MicroRNA inhibitor screening: Searching for angiogenesis modulators in human endothelial cells

Abstract

Cardiovascular diseases represent the highest mortality, morbidity and costs out of any medical condition in Europe and the US. The endpoint for most of these syndromes is heart failure, a stage of decompensated cardiac growth and dysfunction which results in lower cardiac performance. Despite the currently available treatments, the burden of the disease remains high. Therefore, novel strategies are required for its treatment, and while many studies have shown that the improvement of microvascular angiogenesis can have positive effects in the adaptive heart, no biomedical products have been produced yet. In this context, microRNAs appear as a novel, versatile and amenable platform for gene expression modulation, promising the ability of ameliorating heart failure or preventing it altogether. Our group aimed to discover novel microRNAs involved in the regulation of the angiogenic potential of endothelial cells through a proliferation assay-based screening of a microRNA inhibitor library. We tested the effects of 753 microRNA inhibitors in human umbilical vein endothelial cells and evaluated their effects in terms of proliferation induction or repression through a dual staining for total nuclei (Hoechst 33342) and replicative nuclei/DNA (EdU). Our results revealed a number of microRNAs, which are capable of drastically changing endothelial cell proliferation profiles. Among those, we chose to pursue the role of miR-219a-5p as our group had previously found this microRNA as having a role in the cardiac cells. We performed proliferation, scratch wound and tube formation assays in order to confirm the functional role of miR-219 in a human cell line. We observed that overexpression of this microRNA with a precursor resulted in slight proliferative increase compared to control, while inhibitor treatment decreased it, confirming the result from our screening. We were then able to identify manic fringe as a potential target of miR-219, linking this microRNA to the Notch pathway, and thereby to endothelial cell proliferation and angiogenic capacity. Further studies will be necessary in order to validate this potential target as well as clarifying the mechanisms underlying the biological role and relevance of miR-219a-5p.

As doenças cardiovasculares representam a condição médica com maior mortalidade, incidência e custos na Europa e nos EU. A maioria destas síndromes culmina em insuficiência cardíaca, um estado de crescimento cardíaco descompensado e disfuncional que resulta em performance reduzida. Apesar dos tratamentos actualmente disponíveis, o fardo da doença mantém-se elevado. Consequentemente, novas estratégias são requeridas e apesar de vários estudos terem demonstrado que o melhoramento da angiogénese microvascular pode ter efeitos benéficos no coração em adaptação, ainda não há produtos biomédicos disponíveis nesse sentido. Neste contexto, os microRNAs apresentam-se como uma plataforma versátil e modulável para a alteração de expressão génica, com a promessa de atenuar ou prevenir insuficiência cardíaca. O nosso grupo pretendia descobrir microRNAs envolvidos na regulação do potencial angiogénico de células endoteliais através de uma selecção de uma “biblioteca” de inibidores de microRNAs baseada num teste de proliferação. Testámos o efeito de 753 inibidores de microRNAs em células endoteliais da veia umbilical humana e avaliámos os seus efeitos em termos de indução ou repressão de proliferação através de um protocolo de coloração dual para todos os núcleos (Hoechst 33342) e para núcleos/ADN replicativos (EdU). Os nossos resultados revelaram vários microRNAs cuja inibição é capaz de alterar o perfil de proliferação endotelial. Entre estes, escolhemos continuar a estudar o papel do miR-219a-5p uma vez que este já tinha sido detectado previamente como relevante em células cardíacas. Efectuámos testes de proliferação, migração e tubulogénese de modo a confirmar a função do miR-219 em células humanas. Observámos que a sobreexpressão deste microRNAs com precursor resultou num aumento da proliferação de células endoteliais, relativamente ao controlo. Similarmente, a inibição deste microRNAs resultou na diminuição dos parâmetros angiogénicos testados, confirmando resultados prévios. Conseguimos ainda identificar o gene “manic fringe” como um potencial alvo do miR-219, ligando este microRNAs à via de sinalização “Notch”, e consequentemente à proliferação e angiogénese endoteliais. Estudos posteriores serão necessários de forma a validar este alvo bem como clarificar os mecanismos de acção inerentes à função biológica e relevância do miR-219a-5p.