Differences in legionella pneumophila virulence determined in Galleria mellonella infection model

Abstract

Legionella pneumophila is a facultative intracellular gram-negative bacteria ubiquitous in freshwater environments and in many man-made water systems, capable of inducing pneumonia in humans. Legionellae natural hosts are protozoa present in freshwater environments. The association with these organisms is the major factor regulating the presence of the bacterium in the environment. Indeed, protozoa provide the necessary conditions for the growth of legionellae, and they enhance the resistance of these organisms to adverse environmental conditions (Fields et al., 2008; Richards et al., 2013; Abdelhady & Garduño, 2013). In humans the infection caused by the inhalation of legionellae is supported by the ability of these organisms to enter and to multiply within alveolar macrophages, causing the destruction of these phagocytes and damage to the pulmonary tissues. Genus Legionella includes several species but only some have already been associated with legionellosis. Strains belonging to L. pneumophila of serogroup 1 represent the majority of strains related with disease cases (Marrie et al., 2008; Phin et al., 2014). It has been shown that there are clear differences between populations of clinical, man-made and natural environmental isolates, with clinical isolates showing less diversity than man-made and natural environmental isolates suggesting that the former is a subset of the latter’s (Coscollá & González-Candelas, 2009; Harrison et al., 2009; Harrison et al., 2007; Costa et al., 2010; Costa et al., 2012; Costa et al., 2014).The usage of G. mellonella as an infection model for human pathogens has increased in the last few years, mainly due the existence of a good correlation between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models (Harding et al., 2013). A major component of the larvae's immunity is the presence of an innate immune system, with hemocytes, professional phagocytes like the alveolar macrophages in humans. L. pneumophila is able to infect, and replicate within these cells (Harding et al., 2013). The main objective of this study was to determine if unrelated L. pneumophila strains, isolated from different environments and with distinct genetic backgrounds, exhibited different levels of virulence, using G.mellonella larvae as an infection model. In this study we concluded that L. pneumophila virulence in G. mellonella is dosedependent and strain-specific. However all the injected larvae showed morphological alterations after injection with L. pneumophila which made possible to determine that all the strains tested in this study are pathogenic. Moreover, we could not establish a link between L. pneumophila virulence and the strains origin. Multilocus sequence typing is a tool used to discriminate clonal groups within several bacterial species (Harb & Kwaik 1998). A scheme based on this tool has been developed for L. pneumophila, Sequence-based typing (SBT). This tool allowed us to conclude that the SBT profiles did not reconstruct the phylogeny of L. pneumophila species. Additionally, no relation could be established between the SBT profiles and the origin of strains. It was also possible to establish that the SBT profile is not related with the strains virulence in G. mellonella

Legionella pneumophila é uma bactéria gram-negativa intracelular facultativa, ubíqua em ambientes de água não salina e em muitos sistemas artificias de água, capaz de provocar pneumonia em humanos. Os hospedeiros naturais da Família Legionellaceae são protozoários presentes em ambientes de água não salina. A associação com estes organismos é o principal fator a regular a presença desta bactéria neste tipo de ambiente. De facto, os protozoários fornecem condições necessárias para o crescimento de legionellae e aumentam a capacidade de resistência destes organismos contra condições ambientais adversas (Fields, 2008; Richards, 2013; Abdelhady & Garduño, 2013). Em humanos a infeção causada pela inalação de legionellae é intrínseca à capacidade destes organismos para entrarem e se multiplicarem em macrófagos alveolares, causando destruição destes fagócitos e danos nos tecidos pulmonares. O género Legionella inclui várias espécies estando algumas envolvidas em casos de legionelose. As estirpes pertencentes ao serogrupo 1 de Legionella pneumophila representam a maioria das estirpes associadas a casos de doença (Marrie et al., 2008; Phin et al., 2014). Comprovadamente existem diferenças evidentes entre populações de L. pneumophila isoladas de ambientes clínicos, artificiais e naturais. Isolados de ambientes clínicos evidenciam menor diversidade que populações isoladas de ambientes artificiais e naturais, sugerindo que os primeiros são um subgrupo dossegundos (Coscollá & González-Candelas, 2009; Harrison et al., 2009; Harrison et al., 2007; Costa et al., 2010; Costa et al., 2012; Costa et al., 2014). O uso de G. mellonella como modelo de infeção para agentes patogénicos humanos tem aumentado nos últimos anos, principalmente devido a uma boa correlação ente a virulência de várias bactérias no inseto e nos modelos mamíferos (Harding et al., 2013). Este modelo animal é adequado ao estudo da patogenicidade de L. pneumophila uma vez que estas larvas possuem um sistema imunitário inato e fagócitos, células com um comportamento idêntico ao dos macrófagos alveolares em humanos, nos quais L. pneumophila tem a capacidade de infetar e replicar-se (Harding et al., 2013). O principal objetivo deste estudo foi determinar se estirpes de L. pneumophila não relacionadas, isoladas de diferentes ambientes e com diferentes backgrounds genéticos, apresentavam diferentes níveis de virulência, usando larvas de G. mellonella como modelo de infeção. Neste estudo concluímos que a virulência de L. pneumophila é dependente da dose e específica para cada estirpe. No entanto todas as larvas injetadas revelaram alterações morfológicas depois da injeção com L. pneumophila, o que torna possível concluir que todas as estirpes testadas neste estudo são patogénicas. No entanto, não foi possível estabelecer uma relação entre a virulência e a origem das estirpes de L. pneumophila. “Multilocus Sequence Typing” é uma ferramenta usada para descriminar grupos clonais em várias espécies de bactérias (Harb & Kwaik 1998). Um esquema baseado nesta ferramenta específico para L. pneumophila foi desenvolvido, “Sequence-BasedTyping” (SBT). Este método permitiu-nos concluir que os perfis SBT obtidos não reconstroem a filogenia da espécie L. pneumophila. Adicionalmente, não foi possível estabelecer uma ligação entre o perfil SBT e a origem das estirpes. Também foi possível concluir que o perfil SBT não está relacionado com a virulência de cada estirpe em G. mellonella.