Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/33569
Title: MiRNAs and risk gene interactions in Alzheimer's disease: from mechanisms to therapeutics
Authors: Oliveira, Ana Rafaela Gomes Soares 
Orientador: Cardoso, Ana Luísa Colaço
Jurado, Maria Amália da Silva
Keywords: Doença de Alzheimer de início tardio; Neuroinflamação; Genes de risco; PICALM; BIN1; Modulação de miRNAs; Fagocitose
Issue Date: 2016
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência e o seu diagnóstico clínico é apenas possível após a morte. Até recentemente, esta doença era caracterizada por duas principais características patológicas: a deposição extraneuronal do péptido β-amilóide (Aβ) e a presença de agregados intraneuronais da tau hiperfosforilada. Atualmente, a neuroinflamação é também considerada uma característica importante da doença, uma vez que dados experimentais, genéticos e epidemiológicos têm revelado um papel crucial para a ativação do sistema imunitário inato durante o início e a progressão da doença. A recente identificação de novos genes de risco da DA, através de estudos de associação genética de larga escala, com um papel importante nas respostas do sistema imunitário, forneceu evidências adicionais sobre a contribuição das disfunções em células do sistema imune para o agravamento da perda neuronal e do dano tecidular. Até à data, as estratégias terapêuticas usadas para combater ou atrasar a progressão da doença são limitadas e sem sucesso, em parte devido ao diagnóstico tardio e ao aparecimento de sintomas clínicos apenas num estádio avançado da doença. É também importante salientar que, atualmente, alguns miRNAs foram encontrados desregulados na DA, tanto localmente como sistemicamente, o que evidencia a possibilidade de pelo menos parte dos casos de DA estarem ligados a desregulações de miRNAs. Neste contexto, os objetivos principais deste trabalho incluíram a clarificação da contribuição dos novos genes de risco da DA nas vias moleculares subjacentes à patogénese da doença, através da avaliação da expressão destes genes sob diferentes variáveis experimentais, que incluíram: a idade, o estado de ativação das células imunes e o estado da doença. Para além disso, um dos objetivos passou também pela compreensão da importância e potencial terapêutico das estratégias que envolvem a modulação de miRNAs, dirigidas a fagócitos mononucleares, nos mecanismos de limpeza associados à doença. Tendo em consideração a contribuição da microglia para a homeostasia do tecido cerebral, o terceiro e último objetivo deste projeto envolveu a re-diferenciação de monócitos derivados do sangue humano em células semelhantes à microglia, seguindo um protocolo já descrito. Para concretizar estes objetivos, a expressão dos genes de risco em monócitos (derivados do sangue) e macrófagos (derivados de monócitos) foi avaliada em células de indivíduos saudáveis expostas a diferentes estímulos de ativação (M0, M1 e M2). Aexpressão de dois genes em particular, PICALM e BIN1, foi também avaliada em pacientes com DA, pacientes com um défice cognitivo ligeiro e em controlos saudáveis da mesma idade, assim como em indivíduos jovens e idosos saudáveis. Concluímos que os genes de risco da DA apresentam uma expressão diferencial nos diferentes modelos celulares humanos usados, assim como em diferentes estados de ativação. A expressão do PICALM e BIN1 mostrou uma diminuição com a idade, que é agravada em indivíduos com DA ou com um défice cognitivo ligeiro. Tendo em conta que a expressão destes dois genes aumenta no estado de ativação anti-inflamatório M2 e diminuí no estado pro-inflamatório M1, os resultados observados sugerem que o envelhecimento e a demência estão associados a uma transição para um ambiente pró-inflamatório. A influência da modulação dos miRNAs na expressão e função do PICALM e do BIN1 foi também avaliada em células da microglia de ratinho (linha celular N9) e em macrófagos humanos (derivados de monócitos). Observámos uma diminuição na expressão do PICALM e do BIN1 nas células N9, no seguimento de um aumento da expressão do miR-155 e do miR-31, respetivamente. Para além disso, as células N9 apresentaram alterações na sua capacidade fagocítica e na libertação de algumas citoquinas pro- e anti-inflamatórias, após electroporação com os plasmídeos p155, p31 e p200c. Em relação à re-diferenciação dos monócitos em células semelhantes a microglia, os nossos resultados mostraram que, após exposição a IL-34 e GM-CSF, os níveis de alguns marcadores de superfície da microglia e a expressão de genes únicos da microglia nas células diferenciadas não se assemelham aos da microglia derivada do cérebro. No geral, as alterações observadas em genes de risco da DA, em particular no PICALM e no BIN1, mostram uma contribuição destes genes para a patologia da DA. Além disso, nós acreditamos que os nossos estudos, dedicados à modulação de miRNAs, forneceram conhecimento sobre mecanismos epigenéticos envolvidos na regulação da limpeza do peptídeo Aβ, o que pode abrir caminho para o desenvolvimento de novas terapias para a DA baseadas em miRNAs. Contudo, é importante notar que a falta de um bom modelo celular de microglia humana é atualmente um dos maiores obstáculos para a investigação no campo da neuroinflamação, cuja resolução será crucial para um melhor entendimento da contribuição do sistema imunitário na DA e em outras doenças neurodegenerativas e do desenvolvimento.
Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia, whose definitive clinical diagnosis is only possible after death. Until recently, this disease has been characterized by two major pathological hallmarks: the extraneuronal deposition of the β-amyloid peptide (Aβ) and the presence of intraneuronal aggregates of hyperphosphorylated tau (NFTs). Currently, neuroinflammation is also considered an important hallmark of AD, since experimental, genetic and epidemiological data have revealed a crucial role for the activation of the innate immune system during disease onset and progression. The recent identification of several new AD risk genes, by genome-wide association studies (GWAS), found to play a role in immune system responses, provided additional evidence that immune cell dysfunction contributes to aggravate neuronal and tissue loss. To date, the therapeutic strategies used to fight or at least delay the progression of this disease are limited and unsuccessful, in part due to its late diagnosis and to the appearance of clinical symptoms only in a later stage of the disease. Importantly, at the present, several miRNAs were found to be deregulated, both locally and systemically, in AD pathology, which brings forward the possibility of at least part of LOAD cases being linked to miRNA deregulation. In this context, the main goals of this work included the clarification of the newly identified AD risk genes contribution to the molecular pathways underlying AD pathogenesis, by evaluating the expression of these genes under different experimental variables, including age, immune cell activation state and disease status. Moreover, we also aimed to better understand the importance and therapeutic potential of miRNA modulation strategies, directed towards mononuclear phagocytes, in the clearance mechanisms associated with this disease. Taking into consideration the contribution of microglia to brain tissue homeostasis, the third and last goal of this project involved the re-differentiation of microglia-like cells (iMGs) from human blood-derived monocytes (BDMs), following a previously described protocol. To address these goals, the expression of AD risk genes in blood-derived monocytes and monocyte-derived macrophages (MDMs) was evaluated in cells from healthy individuals exposed to different activation states (M0, M1 and M2). The expression of two risk genes in particular, PICALM and BIN1, was also evaluated in AD patients, mild cognitive impairment (MCI) patients and age-matched controls, as well in young andelderly healthy individuals. We concluded that AD risk genes present a differential expression in the different human cell models, as well as in different activation states. PICALM and BIN1 expression shows a reduction with age, which is aggravated in individuals suffering from AD or MCI. Taking into account that the two genes were shown to be increased in the M2 anti-inflammatory activation state and decreased in M1 pro-inflammatory state, it suggests that aging and dementia are associated with a shift towards an inflammatory environment. The impact of miRNA modulation in PICALM and BIN1 expression and function was also evaluated in N9 murine microglia cells and in MDMs. A decrease in the expression of PICALM and BIN, following an increase in miR-155 and miR-31 expression, respectively, was observed in N9. In addition, N9 cells presented changes in their phagocytic ability and in the release of several pro- and anti-inflammatory cytokines, following electroporation with p155, p31 and p200c. Regarding the re-differentiation of iMGs, our results showed that, following BDM differentiation with IL-34 and GM-CSF, the levels of several microglia surface markers and the expression of microglia signature genes do not resemble those of brain-derived microglia cells. Overall, the changes observed in AD risk genes, in particular PICALM and BIN1, show a contribution of these genes to AD pathology. Moreover, we believe that our studies on miRNA modulation provided insights into the epigenetic mechanisms involved in the regulation of Aβ clearance, and may pave the way towards the development of new miRNA-based AD therapies. However, it is important to note that the lack of a good cell model of human microglia is currently a major obstacle to research in the field of neuroinflammation, whose resolution will be crucial for a better understanding of the contribution of the innate immune system to AD and other neurodegenerative and neurodevelopmental disorders.
Description: OLIVEIRA, Ana Rafaela Gomes Soares - MiRNAs and risk gene interactions in Alzheimer's disease: from mechanisms to therapeutics. Coimbra : [s.n.], 2016. Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
URI: http://hdl.handle.net/10316/33569
Rights: embargoedAccess
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