Síntese e Optimização de Nanopartículas Funcionalizadas para a Recuperação Selectiva de Glicoproteínas em Fluídos Humanos

Abstract

A glicosilação é uma das modificações pós-traducionais mais complexas e abundantes na natureza. Este tipo de modificação tem um papel fundamental na actividade e na síntese proteica, assim como na sinalização, crescimento e diferenciação celular. Padrões alterados e glicosilação aberrante são dois fenómenos profundamente correlacionados com diversas doenças, incluindo o cancro. Assim, a monitorização e a descoberta de padrões de glicosilação em fluídos humanos é de enorme importância para a detecção, acompanhamento e desenvolvimento de novos tratamentos. Os fluídos humanos são extremamente complexos e muitos possíveis biomarcadores estão presentes em concentrações muito baixas (na ordem dos nano aos fentomolar), o que os torna muito difíceis de encontrar e monitorizar, fazendo com que o enriquecimento seja um passo fundamental para o seu estudo. Uma das estratégias de enriquecimento mais eficientes tira partido da capacidade das lectinas se ligarem selectivamente a mono ou oligossacarídeos das glicoproteínas, que, associadas a um suporte de imobilização, permitem a captura e enriquecimento destes biomarcadores. Assim, é necessário um suporte de imobilização que permita que a captura seja simples, eficiente e específica. As nanopartículas magnéticas (MNP) vieram, em associação com as lectinas, permitir responder a esta demanda, pois promovem uma interacção tridimensional e multivalente das lectinas com as glicoproteínas, aumentando a especificidade e a eficiência da captura. Neste trabalho, as nanopartículas magnéticas foram revestidas com três lectinas com um largo espectro de captura: Concanavalina A (ConA), wheat germ agglutinin (WGA) e lectina de Maackia amurensis (MA). Uma nova estratégia, baseada na protecção das lectinas pelos seus açúcares de ligação específica antes da ligação às MNPs foi proposta para superar a natureza não-específica desta conjugação. Esta nova metodologia permitiu a preservação da conformação da lectina, aumentando em 40% e 90% a afinidade da ConA e da MA com as glicoproteínas, quando comparadas com a síntese das MNPs com lectina não-protegida. As condições óptimas de trabalho (temperatura e tempo) e as capacidades máximas de ligação foram determinadas para cada lectina, utilizando a fetuína como referência. A comparação com outras estratégias de imobilização foi realizada recorrendo a Sepharose@ConA. As MNP@ConA demonstraram uma afinidade 5 vezes superior para as glicoproteínas que a Sepharose@ConA, quando incubadas com ovalbumina e fetuína. As MNP@Lectinas foram, depois, aplicadas a soro, saliva e urina humana e as proteínas capturadas digeridas com tripsina e analisadas por nano-HPLC MALDI-TOF/TOF. Esta metodologia permitiu a identificação de 180 proteínas, 90% das quais se encontravam glicosiladas de acordo com as ferramentas bioinformáticas utilizadas, revelando um nível muito baixo de ligações inespecíficas. Assim, as MNP@Lectinas demonstraram ser uma ferramenta de elevado valor para estudos glicoproteómicos, especialmente quando lidamos com baixas quantidades de glicoproteínas.

Glycosylation is one of the most abundant and complex posttranslational modification in nature. This type of modification has a key role in the activity and protein synthesis, as well as in signalling, cell growth and differentiation. Altered glycosylation patterns and aberrant glycosylation are deeply correlated with various diseases, including cancer. Thus, monitoring and discovery of glycosylation patterns in human fluids is of great importance for the detection, monitoring and development of new treatments. Human body fluids are extremely complex and many of these biomarkers are present in a very low concentration range (nano to fentomolar), which makes them very difficult to find and monitor, making the enrichment a key step for their study. One of the most effective strategies to enrich takes advantage of the ability of lectins to bind selectively to oligosaccharide complexes of the glycoproteins which, linked to a support of immobilization, allow the capture and enrichment of these biomarkers. The immobilization support must be simple, efficient and specific. The magnetic nanoparticles (MNP) in association with the lectins, appeared to address this demand, because they promote a three-dimensional and multivalent interaction with glycoproteins, increasing the specificity and efficiency of capture. In this study, the magnetic nanoparticles were coated with three broad-spectrum lectins: Concanavalin A (Con A), wheat germ agglutinin (WGA) and Maackia amurensis lectin (MA). A new strategy, based on the protection of lectins with their specific binding sugars before the coupling with the MNPs was proposed to overcome the non-specific nature of this combination. This new methodology has enabled the preservation of the conformation of the lectin, increasing by 40% and 90% the affinity of ConA and MA with the glycoproteins as compared to the synthesis of MNPs with non-protected lectins. The optimum conditions (temperature and time) and the maximum binding capacities were determined for each lectin, using fetuin as a reference. Comparison with other strategies of immobilization was performed using Sepharose @ ConA. The MNP@ConA showed 5 times higher affinity for glycoproteins than ConA@Sepharose, when incubated with fetuin and ovalbumin. The MNP@Lectins were, then, applied to human serum, saliva and urine, and the captured proteins digested with trypsin and analyzed by nano-HPLC MALDI-TOF/TOF. This methodology allowed the identification of 180 proteins, 90% of which were glycosylated according to the bioinformatic tools used, revealinga very low level of non-specific binding. Thus, MNP @ Lectins have shown to be a valuable tool for glycoproteomic studies, especially when dealing with low quantities of glycoproteins.