Pathophysiology of persistent doxorubicin cardiotoxicity : metabolic landscaping of the epigenome

Abstract

Doxorubicin (DOX), a potent and broad-spectrum antineoplastic agent, causes a cumulative dose-dependent cardiomyopathy of late-onset that may ultimately lead to congestive heart failure. The mechanisms responsible for the delayed nature of DOX cardiotoxicity remain poorly understood. Since DOX induces a persistent depression in cardiomyocyte gene expression patterns, it is reasonable to hypothesize that a “toxicity memory” is being formed by means of epigenetic modulation. To test this hypothesis, eight week-old male Wistar rats (n = 6 per group) were administered 7 weekly injections with DOX (2 mg kg−1) or equivalent volume of saline solution and sacrificed two weeks after the last injection. We assessed gene expression patterns by qPCR, global DNA methylation by ELISA and proteome lysine acetylation status by Western blot in cardiac tissue from saline and DOX-treated rats. We show for the first time that DOX treatment decreases global DNA methylation in a cardiac-specific fashion. These differences were accompanied by alterations in mRNA expression of multiple functional gene groups. Doxorubicin disrupted cardiac mitochondrial biogenesis, as demonstrated by reduced mtDNA levels and altered transcript levels for multiple mitochondrial genes encoded by both nuclear and mitochondrial genomes. Transcription of genes involved in lipid metabolism and epigenetic modulation were also disturbed. Western blotting analyses indicated a differential protein acetylation pattern in cardiac mitochondrial fractions of DOX-treated rats. Additionally, DOX treatment increased the activity of histone deacetylases. Overall, the results presented in this thesis support previous observations showing that DOX impairs cardiac mitochondrial function and induces a switch in substrate metabolism. These results are also consistent with the interplay between mitochondrial dysfunction and epigenetic alterations in the persistent nature of DOX-induced cardiotoxicity. One possibility is that DOX may modulate gene expression patterns via alterations to the epigenetic landscape, which could be related to a disturbance in metabolite availability.

A doxorubicina (DOX), um potente fármaco antineoplástico com um amplo espectro de acção, causa uma cardiomiopatia cumulativa, dose-dependente que em última instância pode levar a insuficiência cardíaca. Os mecanismos responsáveis por esta condição ainda não são conhecidos. Como a DOX induz uma depressão persistente nos padrões de expressão genética em cardiomiócitos, podemos teorizar que a DOX imprime uma “memória tóxica” por meio de modulação epigenética. Para testar esta hipótese, ratos machos Wistar Han com oito semanas de idade (n = 6 por grupo) receberam oito injecções subcutâneas semanais de DOX (2 mg kg−1) ou de um volume equivalente de solução salina, sendo sacrificados duas semanas após a última injecção. O nosso trabalho identificou padrões de expressão genética por qPCR, metilação global de DNA por ELISA e o padrão de acetilação de lisinas no proteoma por Western blot em tecido cardíaco. Mostramos pela primeira vez que a DOX diminui os níveis de metilação global de DNA no tecido cardíaco. Este efeito foi acompanhado por alterações na expressão de mRNAs de vários conjuntos funcionais de genes. A DOX alterou a biogénese mitocondrial cardíaca, como identificado por uma redução dos níveis de mtDNA e alterações dos níveis de transcriptos de múltiplos genes mitocondriais codificados por ambos os genomas (nuclear e mitocondrial). A transcrição de genes envolvidos no metabolismo de lípidos e em modulação epigenética também foi alterada. Análises por Western blot revelaram um padrão de acetilação proteica diferente em fracções mitocondriais de animais tratados com DOX. Adicionalmente, o tratamento com DOX aumentou a actividade enzimática de deacetilases de histonas. Colectivamente, os resultados apresentados nesta tese suportam observações anteriores que mostram que a DOX perturba a função mitocondrial e induz uma substituição no substrato metabólico preferencial no coração, sendo também consistentes com a nossa hipótese de que uma acção recíproca entre disfunção mitocondrial e alterações epigenéticas é um factor importante na natureza persistente da toxicidade induzida pela DOX. Uma possível explicação é a de que a DOX modula os padrões de expressão genética através de alterações na paisagem epigenética, o que pode ser consequência de uma perturbação na disponibilidade de metabolitos.