Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/32361
Title: Therapeutic Targeting of CNS Hemangioblastomas in VHL disease
Authors: Metelo, Ana Margarida Martins 
Orientador: Iliopoulos, Othon
Castro, Margarida
Keywords: VHL disease; CNS tumors; hemangioblastomas; targeted therapy; somatic mutations
Issue Date: 23-Mar-2017
Citation: METELO, Ana Margarida Martins - Therapeutic targeting of CNS hemangioblastomas in VHL disease. Coimbra : [s.n.], 2017. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/32361
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/70002/2010/PT 
Abstract: Hemangioblastomas (HBs) são tumores benignos muito vascularizados que se desenvolvem em localizações específicas do Sistema Nervoso Central (SNC), maioritariamente no cerebelo, no tronco cerebral, ao longo da espinal medula e na retina. Estes tumores cerebrais são raros e estão muitas vezes associados à doença genética de VHL. Oitenta por cento destes pacientes desenvolvem vários HBs ao longo da sua vida, por vezes sequencialmente ou mesmo simultaneamente. O único tratamento recomendado é a remoção cirúrgica destes tumores cerebrais; contudo, devido à sensibilidade das áreas afectadas, este procedimento é muitas vezes dificultado ou mesmo impossibilitado. Actualmente, existe uma falta de estudos científicos e de modelos experimentais nesta área que permitam estudar a biologia dos HBs, o que compromete directamente o estudo das causas moleculares da doença e a descoberta de fármacos inovadores. Deste modo, os objectivos desta tese doutoral são a identificação de novos alvos terapêuticos em HBs do SNC, o teste de potenciais novos fármacos num modelo peixe-zebra (Danio rerio) da doença de VHL e, finalmente, o desenvolvimento de um novo modelo animal de ratinho para estudar a biologia destes intrigantes tumores cerebrais. A partir de amostras humanas de HBs do SNC, procedeu-se à sequenciação completa do exoma tumoral através de técnicas inovadoras de sequenciação de “nova geração”, de forma a identificar mutações genéticas características das células tumorais de HB. Através destes resultados, descobriu-se que a inactivação de ambos os alelos do gene de VHL ocorre em todos os tumores e é necessária para o desenvolvimento tumoral. Este processo ocorre através de vários mecanismos genéticos que afectam ambos os alelos do gene de VHL incluindo: mutações génicas de substituição, mutações génicas de perda de nucleótidos ou perda do cromossoma 3 (onde se localiza o gene de VHL). Outras alterações detetadas no cariótipo das células tumorais incluem a perda do cromosoma 8, que foi detectada pela primeira vez em duas amostras de HB. Finalmente, foi identificada uma mutação oncogénica de substituição no gene PNPLA3, que origina um codão de terminação prematuro (mutação de substituição “sem sentido”). Esta mutação específica leva à perda da função enzimática da proteína PNPLA3, causando uma diminuição na quantidade de vacúolos lipídicos característicos das células tumorais VHL-/-. A diminuição nos níveis da proteína PNPLA3 é na verdade uma característica recurrente de células VHL-/-, ocorrendo não só em células tumorais de HB mas também em células tumorais de carcinoma renal. Finalmente, foi demonstrado que a diminuição dos níveis da enzima PNPLA3 especificamente em células VHL-/- promove a via de sinalização tumorigénica dependente de HIF2α e leva a um crescimento seletivo das células cancerígenas em condições metabólicas específicas. Uma das características dos HBs do SNC é o aumento patológico dos factores de transcrição HIF e a activação das respectivas vias de signalização como consequência de mutações no gene VHL. Deste modo, inibidores do oncogene HIF2α foram testados num modelo peixe-zebra (Danio rerio) da doença de VHL como potencial estratégia inovadora para o tratamento desta doença. O modelo animal usado é o único actualmente disponível para estudar a doença de VHL e mimetiza muitos dos fenótipos observados em pacientes com esta doença. Estes embriões peixe-zebra com mutação no gene vhl desenvolvem uma extensa vascularização e angiogénese no cérebro e na retina, defeitos no processo de hematopoiese, proliferação anormal das células epiteliais do rim, anomalias cardíacas e edema generalizado. Neste estudo, foi demonstrado que o tratamento de embriões vhl-/- com o inibidor de HIF2α designado “composto 76” melhora significativamente as anomalias identificadas nestes animais, incluindo os processos angiogénico e hematopoiético, o rendimento cardíaco e ainda a sobrevivência dos embriões vhl-/-. Finalmente, foi também mostrado que os fenótipos observados neste modelo animal são causados directamente pelo oncogene HIF2α, e não pela sua isoforma (denominada HIF1α), sendo que o inibidor “composto 76” é específico para o alvo HIF2α e inibe unicamente as suas proteínas homólogas epas1a e epas1b presentes no peixe-zebra. De modo a expandir o material científico para estudo dos HBs do SNC, foram estabelecidas culturas de células a partir de biópsias de tumores de hemangioblastoma. Estas culturas celulares são bastante heterogéneas e expressam marcadores celulares característicos de células tumorais de HB, tais como as proteínas PDPN, VEGFα e HIF. Injeções ortotópicas destas células no cérebro de ratinhos imunosuprimidos levaram ao desenvolvimento de tumores cerebrais que mimetizam as características dos HBs do SNC em humanos, como por exemplo a histologia do tumor, o seu comportamento benigno e não-invasivo, a captação de agentes de contraste usados em resonância magnética de imagem e, finalmente, a acumulação de lípidos intracelulares. Estas características provam que este modelo de ratinho mimetiza a doença em humanos e deve ser usado para o estudo de HBs do SNC. Em suma, o trabalho doutoral aqui apresentado levou aos seguintes resultados científicos: 1) identificação de uma nova mutação no gene PNPLA3 em tumores de HB; 2) validação de um composto terapêutico inibidor da proteína HIF2α para o tratamento dos fenótipos associados à doença de VHL num modelo de peixe-zebra; 3) desenvolvimento do primeiro modelo tumoral de HB em ratinho, o que será essencial para o estudo da biologia destes tumores cerebrais e para o teste de potenciais estratégias terapêuticas.............................................................Central Nervous S ystem Hemangioblastomas (CNS HBs) are benign and highly vascular tumors that arise most frequently in the cerebellum, brainstem, spinal cord and retina. These rare tumors are usually associated with the familial VHL disease , and eighty percent of VHL patients develop sequential or simultaneous HBs throughout t heir life. The only effective treatment for these lesions is surgery, which can be extremely challenging or impossible to perform due to the sensitive location of these tumors. The lack of scientific studies and experimental resources to study this tumor t ype strongly compromises t he understandi ng of the disease and the discovery of effective treatments. The main goal s of this doctoral work are the identi fication of novel therapeutic targets for CNS HBs, the test ing of potential treatments in a zebrafish mo del of VHL disease and the establishment of a novel HB mouse model to clarify intriguing questions regarding the biology and cell of origin of HBs. Taking advantage of HB human samples, we performed next - generation whole - exome sequencing to discover the ma in genetic alterations that occur in HB tumor cells. We discovered that complete inactivation of the VHL gene is necessary for HB formation. The inactivation of this gene occurred in both alleles for all tumors through germline mutation s , copy number loss of chromosome 3, somatic point mutation s and point deletion s . Loss of chromosome 8 was also detected in two out of eight samples. I n addition, we identified and confirmed a nonsense mutation in the PNPLA3 gene . This specific mutation leads to loss of the a cyl - transferase activity of the protein , diminishing the accumulation of lipid droplet s characteristic of VHL - / - cells . Furthermore, w e showed that d own regulation of PNPLA3 is a recurrent event in VHL - associated tumors that occurs in both CNS HBs and clear cel l renal cell carcinomas . Finally, we demonstrated that low levels of PNPLA3 in VHL - / - cancer cells stimulate oncogenic HIF 2α signaling and promote a selective growth advantage in metabolic stress conditions. Considering that disrupted VHL - HIF signaling is a hallmark of CNS Hemangioblastomas, we tested novel HIF2α small - molecule inhibitors as an innovative targeted strategy fo r the treatment of VHL - / - tumors. We used the only animal model of VHL disease that faithfully recapitulate s the human phenotype s , which is the vhl - / - zebrafish embryo. These embryos develop pathologic angiogenesis with hypervascularization in the brain an d in the retina mimicking CNS HBs , abnormal hematopoiesis, renal proliferation, cardiac abnormalities and severe edema. Treatment with the HIF2α inhibitor compound 76 ameliorates the pathologic vessel proliferation and abnormal hematopoiesis, improves t he cardiac output and partially rescues the survival of vhl - / - embryos . Moreover, w e showed that the VHL phenotype is specifically driven by H IF2α and not HIF1α , and these compounds specifically inhibit E pas1a and E pas1b, which are the zebrafish homologues of the human HIF2α. In order to expand the scientific resources to study CNS HBs we established HB tumor - derived cell cultures . The highly h eterogeneous polyclonal populations express HB tumor cell markers such as PDPN , VEGF α and HIF . O rthotopic injections of these HB - derived cells in the brain of immunocompromised mice generate proliferative brain tumors that recapitulate several features of the human CNS HBs , including their cellular histology and benign profile, the strong uptake of MRI contrast agents and the high lipid content. These characteristic s highlight the potential of this model t o study the HB disease . In summary, t his doctoral w ork led to : i) the identification of a novel mutation in CNS HBs, ii) the validation of HIF2α inhibitors for the treatment of VHL - associated phenotypes , and iii) the establishment of an unique mouse model crucial for the study of CNS HB biology and specific therapeutic strategies.
Central Nervous System Hemangioblastomas (CNS HBs) are benign and highly vascular tumors that arise most frequently in the cerebellum, brainstem, spinal cord and retina. These rare tumors are usually associated with the familial VHL disease, and eighty percent of VHL patients develop sequential or simultaneous HBs throughout their life. The only effective treatment for these lesions is surgery, which can be extremely challenging or impossible to perform due to the sensitive location of these tumors. The lack of scientific studies and experimental resources to study this tumor type strongly compromises the understanding of the disease and the discovery of effective treatments. The main goals of this doctoral work are the identification of novel therapeutic targets for CNS HBs, the testing of potential treatments in a zebrafish model of VHL disease and the establishment of a novel HB mouse model to clarify intriguing questions regarding the biology and cell of origin of HBs. Taking advantage of HB human samples, we performed next-generation whole-exome sequencing to discover the main genetic alterations that occur in HB tumor cells. We discovered that complete inactivation of the VHL gene is necessary for HB formation. The inactivation of this gene occurred in both alleles for all tumors through germline mutations, copy number loss of chromosome 3, somatic point mutations and point deletions. Loss of chromosome 8 was also detected in two out of eight samples. In addition, we identified and confirmed a nonsense mutation in the PNPLA3 gene. This specific mutation leads to loss of the acyl-transferase activity of the protein, diminishing the accumulation of lipid droplets characteristic of VHL-/- cells. Furthermore, we showed that downregulation of PNPLA3 is a recurrent event in VHL-associated tumors that occurs in both CNS HBs and clear cell renal cell carcinomas. Finally, we demonstrated that low levels of PNPLA3 in VHL-/- cancer cells stimulate oncogenic HIF2α signaling and promote a selective growth advantage in metabolic stress conditions. Considering that disrupted VHL-HIF signaling is a hallmark of CNS Hemangioblastomas, we tested novel HIF2α small-molecule inhibitors as an innovative targeted strategy for the treatment of VHL-/- tumors. We used the only animal model of VHL disease that faithfully recapitulates the human phenotypes, which is the vhl-/- zebrafish embryo. These embryos develop pathologic angiogenesis with hypervascularization in the brain and in the retina mimicking CNS HBs, abnormal hematopoiesis, renal proliferation, cardiac abnormalities and severe edema. Treatment with the HIF2α inhibitor compound 76 ameliorates the pathologic vessel proliferation and abnormal hematopoiesis, improves the cardiac output and partially rescues the survival of vhl-/- embryos. Moreover, we showed that the VHL phenotype is specifically driven by HIF2α and not HIF1α, and these compounds specifically inhibit Epas1a and Epas1b, which are the zebrafish homologues of the human HIF2α. In order to expand the scientific resources to study CNS HBs we established HB tumor-derived cell cultures. The highly heterogeneous polyclonal populations express HB tumor cell markers such as PDPN, VEGFα and HIF. Orthotopic injections of these HB-derived cells in the brain of immunocompromised mice generate proliferative brain tumors that recapitulate several features of the human CNS HBs, including their cellular histology and benign profile, the strong uptake of MRI contrast agents and the high lipid content. These characteristics highlight the potential of this model to study the HB disease. In summary, this doctoral work led to: i) the identification of a novel mutation in CNS HBs, ii) the validation of HIF2α inhibitors for the treatment of VHL-associated phenotypes, and iii) the establishment of an unique mouse model crucial for the study of CNS HB biology and specific therapeutic strategies.
Description: Tese de doutoramento em Biociências, na especialidade de Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/32361
Rights: embargoedAccess
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