Title: O neuropeptídeo Y e os seus receptores na retina : da proliferação celular à neuroprotecção
Authors: Álvaro, Ana Rita Costa Silva 
Keywords: biologia celular;biologia molecular;neuropeptídeo y;receptores de neuropeptídeo y;retina;N-metil-3,4-metilenodioxianfetamina, toxicidade;MDMA;ecstasy
Issue Date: 15-May-2008
Abstract: O neuropeptídeo Y (NPY) é o peptídeo mais abundante no sistema nervoso central e periférico, e está também presente na retina. Porém, a função do NPY na retina está ainda por esclarecer. Com esta tese, pretendeu-se aumentar o estado actual do conhecimento sobre as funções que o NPY pode desempenhar na retina. Neste estudo começou-se por caracterizar a expressão do NPY nas células da retina, tendo-se utilizado diversos modelos experimentais (retina, cultura primária mista de células da retina, cultura primária de células de microglia da retina e linhas celulares de células de Müller e de células endoteliais de rato). Os resultados obtidos revelaram que o NPY está presente na retina de rato e, em particular, em diferentes tipos de células da retina: neurónios, macroglia (células de Müller), microglia e células endoteliais. Além disso, por RT-PCR, demonstrou-se que as culturas mistas de células da retina expressam o ARNm dos receptores Y1, Y2, Y4 e Y5 do NPY. As células endoteliais expressam o ARNm dos receptores Y1, Y2 e Y4. Nesta tese, investigou-se, em neurónios da retina de rato em cultura, o papel do NPY nas alterações da [Ca2+]i e quais os receptores do NPY envolvidos. O NPY (100 nM) inibiu os aumentos da [Ca2+]i induzidos por 30 mM de KCl em cerca de 50% dos neurónios analisados. Assim, de acordo com as razões Δ2/Δ1, e considerando que nos neurónios do controlo Δ2/Δ1<=0,80, os neurónios foram divididos em dois grupos: grupo A - neurónios que não respondem a NPY (⏊/⏉<=0,80); grupo B - neurónios que respondem a NPY (Δ2/Δ1<0,80). Utilizando ferramentas farmacológicas, pretendeu-se identificar os receptores que medeiam o efeito inibitório do NPY nos neurónios da retina. Assim, os agonistas dos receptores Y1/Y5 ([Leu31,Pro34]NPY; 100 nM), Y4 (r-PP; 100 nM) e Y5 (NPY19-23(Gly1, Ser3, Gln4, Thr6, Ala31, Aib32, Gln34)PP; 100 nM), mas não o agonista do receptor Y2 (NPY13-36; 300 nM), inibiram o aumento da [Ca2+]i induzida por KCl. Por outro lado, o efeito do NPY nas alterações da [Ca2+]i foi inibido na presença dos antagonistas dos receptores Y1 (BIBP3226; 1 μM) e Y5 (L-152,804; 1 μM). Deste modo, pode concluir-se que, nos neurónios da retina, o NPY inibe o aumento da [Ca2+]i induzido por KCl, através da activação dos receptores do NPY do subtipo Y1, Y4 e Y5, podendo este efeito ser visto como um possível mecanismo neuroprotector em doenças neurodegenerativas da retina, de que é exemplo o glaucoma. Avaliou-se, ainda, o papel do NPY na proliferação de células da retina de rato. O NPY (10-1000 nM) estimulou a proliferação celular, através da activação dos receptores do NPY do subtipo Y1, Y2 e Y5. O NPY também aumentou o número de células progenitoras em proliferação (células positivas para o 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU) e para a nestina; células BrdU+/nestina+). Com base nestes resultados, investigaram-se os mecanismos intracelulares, associados à activação dos receptores do NPY, envolvidos no aumento da proliferação celular. O efeito estimulatório do NPY na proliferação celular foi reduzido pelo L-NAME (500 μM), um inibidor da sintase do monóxido de azoto (NO), pelo ODQ (20 μM), um inibidor da isoforma solúvel da guanilil ciclase (sGC), e pelo U0126 (1 μM), um inibidor da cinase extracelular induzida por factores mitogénicos (MEK) 1/2. Em conclusão, o NPY estimula a proliferação de células da retina, incluindo células progenitoras, sendo este efeito mediado através das vias do NO-GMPc e da ERK 1/2. A 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA; “ecstasy”) tem efeitos estimulatórios potentes no sistema nervoso central. Apesar de alguns estudos terem demonstrado a presença de quantidades apreciáveis de MDMA no humor vítreo e de poderem ocorrer consequências visuais graves devido do consumo da MDMA, o efeito tóxico da MDMA na retina ainda não está completamente esclarecido. Assim, investigou-se o efeito neurotóxico da MDMA nas células da retina e avaliou-se, também, o potencial efeito protector do NPY contra a toxicidade induzida pela MDMA. Nas culturas primárias mistas da retina, a MDMA induziu a morte em todos os tipos de células presentes na cultura: neurónios, macroglia e microglia. A MDMA induziu necrose (avaliada pela marcação com iodeto de propídio, PI) e apoptose (avaliada pelo aumento da imunorreactividade da caspase-3 activa), de forma dependente da concentração. A toxicidade induzida pela MDMA foi potenciada pelo aumento da temperatura (de 37ºC para 40ºC). O efeito tóxico da MDMA nas células da retina foi mediado, em parte, pela activação dos receptores 5-HT2A, uma vez que a presença do antagonista dos receptores 5-HT2A (quetanserina, 1 μM) inibiu significativamente esse efeito. Além disso, o NPY também reduziu significativamente a morte celular das células da retina de rato causada pela exposição a MDMA. Assim, os resultados obtidos indicam que a MDMA causa um efeito tóxico não específico nas células da retina em cultura, que é potenciado pela elevação da temperatura, e que envolve a activação dos receptores 5-HT2A. O NPY exerce um potente efeito protector contra a neurotoxicidade induzida pela MDMA, pelo que o NPY ou análogos do NPY poderão ser utilizados como agentes protectores contra a degeneração retiniana induzida por drogas de abuso ou em doenças oculares. Em resumo, o NPY e os seus receptores estão presentes na retina de rato. O NPY é expresso em neurónios, células da macroglia e microglia e também em células endoteliais da retina. Esta distribuição do NPY por diferentes tipos de células na retina sugere que o mesmo poderá desempenhar múltiplas funções fisiológicas. De facto, o NPY modula as alterações da [Ca2+]i e promove a proliferação de células da retina, incluindo células progenitoras. Além disso, o NPY tem efeitos neuroprotectores potentes, que poderão ser aproveitados para desenvolver estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças degenerativas da retina, nomeadamente no tratamento do glaucoma.
Neuropeptide Y (NPY) is the most abundant peptide in the central and peripheral nervous systems, and is also present in the retina. However, the function of NPY in the retina has remained unknown. Thus, the present study aimed to investigate the role of NPY in the retina. Firstly, the characterization of the NPY expression in rat retinal cells was analyzed using several experimental models [(retina, primary culture of retinal neural cells, microglial cell cultures, and rat Müller cell line (TR-MUL) and retina endothelial cell line (TR-iBRB2)] was investigated. The results obtained showed that NPY is present in the rat retina, namely in different retinal cell types: neurons, macroglial (Müller cells), microglial and endothelial cells. Moreover, through RT-PCR, we detected the expression of NPY Y1, Y2, Y4 and Y5 receptors in the retinal cells in culture, as well as NPY Y1, Y2, Y4 receptors in retinal endothelial cells. Secondly, both the role of NPY on intracellular calcium ([Ca2+]i) changes in retinal neurons and the NPY receptors involved in the process were studied. NPY (100 nM) decreased the [Ca2+]i amplitudes evoked by 30 mM KCl in nearly 50% of neurons analyzed. Therefore, based on the Δ2/Δ1 ratios, and taking into account that control neurons Δ2/Δ1<=0.80, neurons were divided into two groups: group A - NPY-non-responsive neurons (Δ2/Δ1<=0.80); group B - NPY-responsive neurons (Δ2/Δ1<0.80). Using pharmacological tools, the NPY receptors involved in the inhibitory effect induced by NPY in rat retinal neurons were also identified. The NPY Y1/Y5 ([Leu31,Pro34]NPY; 100 nM), Y4 (r-PP; 100 nM) and Y5 (NPY19-23(Gly1, Ser3, Gln4, Thr6, Ala31, Aib32, Gln34)PP; 100 nM) receptor agonists, but not the Y2 receptor agonist (NPY13-36; 300 nM), inhibited the [Ca2+]i increase induced by elevated KCl. On the other hand, the inhibitory effect of NPY on the [Ca2+]i changes was reduced in the presence of the Y1 (BIBP3226; 1 μM) and Y5 (L-152,804; 1 μM) receptor antagonists. In conclusion, NPY inhibits KCl-evoked [Ca2+]i in retinal neurons through the activation of NPY Y1, Y4 and Y5 receptors, and this effect may be viewed as a potential neuroprotective mechanism of NPY in retinal neurodegenerative diseases, such as glaucoma. Thirdly, the role of NPY on the proliferation of rat retinal neural cells was evaluated. NPY (10 – 1000 nM) stimulated cell proliferation through the activation of NPY Y1, Y2 and Y5 receptors and also increased the proliferation of neuronal progenitor cells (BrdU+/nestin+ cells). Based on these results, the intracellular mechanisms coupled to NPY receptors activation that mediate the increase in cell proliferation, were also investigated. The stimulatory effect of NPY on cell proliferation was reduced by L-NAME (500 μM), a nitric oxide (NO) synthase inhibitor, ODQ (20 μM), a soluble guanylyl cyclase (sGC) inhibitor or U0126 (1 μM), a mitogen-induced extracellular kinase (MEK) 1/2 inhibitor. In conclusion, NPY stimulates retinal neural cell proliferation, including neuronal precursor cells, and this effect is mediated through NO-cGMP and ERK 1/2 pathways. 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) has potent central nervous system stimulant effects. Although some studies have demonstrated that considerable amounts of MDMA reach the vitreous humor and that serious visual consequences can result from MDMA consumption, the toxic effect of MDMA on the retina is not completely elucidated. Indeed, the neurotoxic effect of MDMA on rat retinal neural cells was evaluated, as well as the potential neuroprotective role of NPY on MDMA-induced toxicity. In primary cultures of rat retinal neural cells, MDMA-induced cell death was evident in all cell types present in the culture: neurons, macroglial and microglial cells. MDMA induced necrosis (propidium iodide assays) and apoptosis (increase of activated caspase-3 immunoreactivity) in retinal neural cells in a concentration-dependent manner. MDMA-induced toxicity was potentiated at higher temperatures (40°C, comparing to 37ºC). In retinal cells, the toxic effect of MDMA was mediated, at least in part, by the activation of 5HT2A receptors, since the 5HT2Areceptor antagonist (ketanserin, 1 μM) significantly inhibited that effect. Interestingly, necrotic and apoptotic cell death induced by MDMA was potently inhibited by NPY (100 nM). Therefore, these results suggest that MDMA induces a non-specific toxic effect in retinal neural cells, which is potentiated by elevated temperature and involves the activation of 5-HT2A-receptor. Moreover, NPY is a potent neuroprotector against the DMA-induced toxicity, suggesting that NPY or NPY analogues might be useful agents against retinal degeneration induced by drugs or in eye diseases. In summary, NPY and NPY receptors are present in rat retina. NPY is expressed in neurons, macroglial and microglial cells, and also in retinal endothelial cells. The NPY distribution by different retinal cell types suggests that this peptide could participate in multiple physiological functions in the retina. In fact, NPY modulates the [Ca2+]i changes and stimulates the proliferation of retinal cells, including progenitor cells. Furthermore, NPY demonstrates potent neuroprotective effects that might be useful to develop new therapeutic strategies to treat retinal degenerative diseases, such as in glaucoma.
Description: Tese de Doutoramento em Ciências e Tecnologias da Saúde (Biologia Celular e Molecular), apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/319
Rights: openAccess
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