Under Pressure

Abstract

A hipertensão pulmonar (HTP) não é uma doença, mas sim um estado patológico definido do ponto de vista hemodinâmico por uma pressão média na artéria pulmonar superior ou igual a 25 mmHg. As várias formas de HTP encontram-se classificadas em categorias baseadas em parâmetros clínicos, mecanismos etiológicos e na sua resposta à terapêutica. A HTP condiciona sempre um agravamento de prognóstico quando se encontra associada a outras doenças. A sua forma mais grave é denominada hipertensão arterial pulmonar (HAP), levando frequentemente a insuficiência cardíaca direita. Apesar dos grandes desenvolvimentos científicos e do surgimento de novas terapêuticas, a mortalidade mantém-se muito elevada. De forma a compreender a epidemiologia da HAP em Portugal, conduzimos um registo prospetivo e multicêntrico de doentes incidentes. Os resultados obtidos revelaram uma incidência de cerca de 1,5 casos por milhão, semelhante à reportada noutros países. Por outro lado, a idade dos doentes era mais baixa e a proporção de doentes com formas de HAP associadas a cardiopatia congénitas (HAP-CC) era superior à reportada noutros registos internacionais. Independentemente disso, o prognóstico a médio-prazo foi comparável ao reportado na literatura internacional. Dado o mau prognóstico dos doentes com HAP, o diagnóstico precoce é fundamental. Uma das técnicas disponíveis para o rastreio de HAP em doentes em alto risco de desenvolver a doença, como aqueles com esclerose sistémica (ES), consiste na avaliação das respostas hemodinâmicas da circulação pulmonar ao esforço. A ecocardiografia de esforço permite avaliar a pressão sistólica da artéria pulmonar (PSAP) em esforço e portanto, encontra-se bem posicionada para essa tarefa. A HTP de esforço (HTPex) pode dever-se tanto à presença de doença vascular pulmonar incipiente (HTP pré-capilar, avaliada pela estimativa da PSAP), como também à presença de disfunção ventricular esquerda (HTP pós-capilar, estimada pelo marcador ecocardiográfico E/e’). Como apenas a forma pré-capilar de HTPex precede o aparecimento de HAP, e consequentemente, é um eventual alvo terapêutico, avaliámos a prevalência de HTPex pré-capilar em doentes com ES. Colocámos a hipótese de que, na maioria dos doentes com ES, a elevação da PSAP durante o esforço seria de causa pré-capilar. Metade dos doentes estudados tinham de facto HTPex; no entanto, entre estes doentes, apenas um quinto demonstrava elevações da razão E/e’ (sugerindo HTP pós-capilar como etiologia para as elevações da PSAP durante o exercício). Os resultados permitiram concluir que as elevações da PSAP em doentes com ES durante o exercício se encontram relacionadas com HTP pré-capilar na maioria dos doentes com ES. A realização de uma revisão sistemática sobre este tema salientou as limitações na evidência disponível e a heterogeneidade de métodos utilizados para avaliar as respostas hemodinâmicas ao esforço. De facto, serão necessários mais estudos prospetivos e com protocolos padronizados, de forma a permitir a correta interpretação dos resultados desta promissora técnica diagnóstica. A fase seguinte do projeto focou-se na identificação de novos biomarcadores de HAP em fase pré-clínica. De forma a responder a esta questão, investigámos se os níveis plasmáticos de certos microRNA (miR) poderiam servir de marcadores diagnósticos e prognósticos na HAP. Identificámos que o miR-424(322) se encontrava aumentado em doentes com HAP e que os seus níveis se encontravam associados à progressão da doença. No subgrupo de doentes com HAP-CC, o miR-424(332) demonstrou valor prognóstico independente. Adicionalmente, com recurso a aplicações bioinformáticas, identificámos que a SMURF1, uma enzima E3-ligase que catalisa a ubiquitinação das SMAD1/5 (as proteínas intracelulares mediadoras da via de sinalização do BMPR-2), poderia ser um alvo do miR-424(322). Os nossos resultados demonstraram que o miR-424(322) pode regular de forma positiva a via do BMPR-2, através da diminuição dos níveis de SMURF1. Além disso, avaliámos os níveis de miR-424(322) durante a progressão da hipertrofia ventricular direita num modelo animal de HAP (rato injetado com monocrotalina). Demonstrámos que os níveis de miR-424(322) variam de modo bifásico, com um aumento transitório após a injeção do tóxico, para posteriormente diminuir durante a doença. Os níveis de SMURF1 variam de modo oposto aos níveis de miR-424(322), o que está de acordo com o facto da SMURF1 ser um alvo deste miR. A comunicação entre os cardiomiócitos através das junções comunicantes (JC) é altamente eficiente e regulada, de forma a garantir a normalidade da função cardíaca. Deste modo, os mecanismos que levam à alteração da comunicação intercelular, nomeadamente através da degradação da conexina 43 (Cx43), a principal proteína constituinte das JC, podem estar associados a doenças cardiovasculares. Sabe-se que também a HAP se encontra associada à remodelagem da Cx43 no ventrículo direito, mas as enzimas que sinalizam a degradação da Cx43 em contexto patológico são pouco conhecidas. Uma vez que a SMURF1 pertence à família HECT de E3-ligases da ubiquitina (enzimas que catalisam a ubiquitinação da Cx43), colocámos a hipótese de que a SMURF1 seria uma nova E3-ligase envolvida na regulação do ciclo de degradação da Cx43. Neste estudo, demonstramos que a SMURF1 é um mediador regulatório no ciclo de vida das JC de Cx43. Assim, a SMURF1 pode modular a função do cardiomiócito e ter um papel na progressão da hipertrofia ventricular direita. Em suma, o nosso projeto salienta o papel fundamental do miR-424(322) como um mediador comum entre a via do BMPR-2 e as vias de comunicação intercelular através das JC, conferindo a este mediador um papel importante nas doenças associadas ao aumento da pós-carga ventricular direita, tornando-o num promissor alvo terapêutico.

Pulmonary hypertension (PH) is not a disease per se but rather a pathophysiological state defined by a mean pulmonary arterial pressure ≥25 mmHg. PH occurs in a variety of clinical situations and is associated with a broad spectrum of histological patterns and abnormalities. Because of this diversity, a classification system for PH has been developed to categorize the disease based on common clinical parameters, potential etiologic mechanisms, and treatment responses. Although any form of PH can increase morbidity and mortality, pulmonary arterial hypertension (PAH) is a particularly severe and progressive form of PH that frequently leads to right ventricular (RV) failure and premature death. Despite important advances in understanding the mechanisms of PAH and the advent of effective therapies, mortality remains unacceptably high. To understand the epidemiology and natural history of PAH, we conducted a prospective, multicenter registry on incident patients in Portugal. The results show a comparable epidemiology to that reported in other European registries, with an estimated incidence of 1.5 per million. However, the patients enrolled in our study were younger and there was a higher proportion of cases with PAH associated with congenital heart disease (PAH-CHD) as compared to those in other European registries. Medium-term prognoses were similar to those reported in other studies. Given the importance of an early diagnosis, we evaluated the utility of exercise echocardiography to screen for PAH. One approach is to identify patients with exercise-induced pulmonary hypertension (EIPH). EIPH can be caused by latent pulmonary vascular disease (pre-capillary EIPH), but it can also be associated to left ventricular (LV) diastolic dysfunction (post-capillary EIPH). As only the pre-capillary form is a precursor of PAH and, consequently, a treatment target for pulmonary vasodilators, we studied the prevalence of EIPH in patients at high risk of developing PAH: systemic sclerosis (SSc) patients. We examined the association between pulmonary pressure and an index of LV dysfunction, E/e’, to test the hypothesis that pre-capillary PH was the cause of EIPH in most SSc patients. Our results demonstrate that half of the enrolled patients developed EIPH, with one-fifth presenting concomitant elevations in E/e’, suggesting post-capillary PH. We concluded that EIPH is related to pre-capillary EIPH in most SSc patients. To better characterize the role of exercise echocardiography, we conducted a systematic review aiming to summarize studies that investigated EIPH using echocardiography in patients with SSc. We found high heterogeneity among the methods, protocols and responses to exercise. Newer, event-based prospective studies with standardized protocols are paramount to accurately characterize exercise echocardiography findings. We next sought to identify new, pre-clinical markers of disease. To address this question, we investigated whether the levels of specific circulating microRNAs (miRs) could constitute reliable markers of diagnostic and prognostic interest for PAH. We found that miR-424(322) was upregulated in PAH patients, and levels of this miR were correlated with disease progression, namely functional class and hemodynamics. In the PAH-CHD subgroup, miR-424(322) levels demonstrated independent prognostic value. Based on bioinformatic analysis, we hypothesized that miR-424(322) targets SMURF1, an E3 ubiquitin ligase that signals the degradation of SMAD1/5, the intracellular mediators of the canonical PAH BMPR-2 pathway. Strikingly, we found that miR-424(322) could positively regulate the BMPR-2 pathway by targeting SMURF1. Furthermore, we used the monocrotaline rat model of PH to investigate changes in circulating miR-424(322) levels throughout disease progression. We demonstrated that miR-424(322) levels vary in a biphasic pattern, with an abrupt, transient increase immediately after the insult and a decrease later in disease progression. SMURF1 displayed an opposite pattern, strongly suggesting in vivo targeting of SMURF1 by miR-424(322). Although regulated and efficient gap junction-modulated communication between cardiomyocytes is critical to ensure cardiac function, not surprisingly, the mechanisms that lead to impaired intercellular communication – typically, increased degradation of Connexin 43 (Cx43) – have been implicated in various heart diseases. Additionally, PAH is associated with RV remodeling-associated degradation of Cx43, a major protein involved in gap junction intercellular communication. However, the enzymes that signal Cx43 degradation in the RV of a diseased heart remain poorly defined. Given that SMURF1 belongs to the NEDD4 family of HECT E3-ubiquitin ligases that are known to catalyze Cx43 ubiquitination, we hypothesized that SMURF1 would constitute an additional E3 ligase involved in the regulation of the Cx43 life cycle. Here we demonstrate that SMURF1 is a novel regulatory player in the Cx43 gap junction life cycle. Therefore, it may modulate cardiomyocyte function and have a putative role in the progression of RV hypertrophy. In summary, our work highlights the critical role of miR-424(322) as a common mediator of the crosstalk between BMPR-2 signaling and intercellular communication mechanisms, ascribing this miR an important role in diseases associated with elevated pulmonary pressures, making it a very promising target.