Otimização da técnica de array CGH em diagnóstico pré-natal

Abstract

A implementação da tecnologia de array CGH como rotina no diagnóstico pré-natal tem vindo a ser discutida nos últimos tempos. Contudo, esta introdução necessita de uma estratégia adequada que garanta a obtenção de DNA de qualidade diretamente a partir de amostras fetais, sem recorrer a cultura de células. Neste estudo delineou-se e otimizou-se uma estratégia de extração e purificação de DNA a partir de líquido amniótico direto, que permitiu a realização de array CGH em diagnóstico pré-natal. Foram selecionados dois protocolos comerciais de extração de DNA que foram otimizados e comparados entre si, de modo a determinar o que apresentava melhor rendimento e qualidade. O controlo da qualidade do DNA obtido foi feito recorrendo a espectrofotometria, a análise do grau de fragmentação através de corrida em gel de agarose e a uma validação dos resultados através de aplicação comparativa numa plataforma de array CGH 180K. A estratégia que garantiu melhores concentrações de DNA de qualidade para análise foi validada recorrendo a 10 amostras de líquido amniótico direto. O estudo efetuado demonstrou que a maioria das amostras, principalmente com um menor número de semanas de gestação, necessitam da realização de um protocolo adicional de concentração e purificação de DNA, para além do protocolo de extração de DNA, de modo a garantir os parâmetros mínimos de quantidade e qualidade para a realização de pelo menos um ensaio de array CGH. A comparação de DNA extraído pelos dois protocolos otimizados não revelou diferenças significativas entre si, e, como tal, optou-se por adotar, na estratégia de extração, o protocolo com a melhor relação custo/benefício. A validação da estratégia estudada em 10 amostras de líquido amniótico revelou valores de quantidade e qualidade de DNA que permitem a realização de array CGH para os volumes iniciais de líquido testados. Os resultados deste trabalho reforçam a importância da tecnologia de array CGH em DPN e demonstram uma estratégia de extração, concentração e purificação de DNA, partindo de líquido amniótico direto recolhido a partir das 15 semanas de gestação com parâmetros de quantidade/qualidade que permitem a realização de array CGH.

The implementation of array CGH as a routine in prenatal diagnosis has recently been discussed. However, this introduction needs a proper strategy that ensures obtaining quality DNA directly from fetal samples. This study a strategy was outlined and optimized for extraction and purification of DNA from uncultured amniotic fluid, which allowed for array CGH in prenatal diagnosis. Two DNA extraction protocols were selected, optimized and compared in order to determine which of them had better yield and quality. The quality control of the DNA obtained was done using spectrophotometry, the analysis of the degree of fragmentation by running agarose gel and a validation of results through a comparative application of array CGH 180K platform. The strategy that assured better concentrations of quality DNA for analysis was validated using 10 samples of amniotic fluid directly. The study shows that the majority of the samples, particularly those with a smaller number of weeks of pregnancy, need to complete an additional protocol for concentration and purification of DNA, in addition to the DNA extraction protocol, in order to ensure the minimum parameters of quantity and quality to perform at least one test array CGH. A comparison of DNA extracted by the two optimized protocols revealed no significant differences between them, and so, it was decided to adopt the least expensive protocol in the strategy of extraction. The validation of the strategy studied in 10 amniotic fluid samples revealed values of quantity and quality of DNA that allow to carry out the array CGH for the initial liquid volumes tested. The results of this study reinforce the importance of array CGH technology in prenatal diagnosis and demonstrate a strategy of extraction, concentration and purification of DNA, from direct amniotic fluid collected from 15 weeks of gestation with parameters of quantity / quality that enable to carry out of array CGH.