Protection provided by phytoestrogens against cardiac lipotoxicity induced by palmitic acid

Abstract

A menopausa é um processo biológico natural caracterizado pela redução dos níveis hormonais, nomeadamente, o estrogénio e progesterona. A perda de estrogénios parece desencadear uma cascata de eventos, levando ao aumento do risco para doenças cardiovasculares. A conjugação do processo de envelhecimento e perda de estrogénio durante a menopausa tem um impacto negativo no metabolismo dos lípidos no coração, o que resulta no aumento da lipotoxicidade e portanto do risco de doenças cardiovasculares. Estruturalmente semelhantes ao 17β-estradiol, os fitoestrogénios, são compostos derivados de plantas que podem exibir actividade estrogénica ou anti-estrogénica, demostrando em vários estudos um impacto positivo nas doenças cardiovasculares. Assim, o principal objetivo do nosso estudo foi investigar se coumestrol e enterodiol, dois promissores fitoestrogénios, são eficientes em proteger o tecido cardíaco contra lipotoxicidade induzida por ácidos gordos livres. O Estradiol também foi usado, como um controlo positivo. A linha celular H9c2 foi usada como um modelo in vitro para células cardíacas, de modo a investigar a lipotoxicidade induzida pelo ácido palmítico, bem como a possível protecção do coumestrol e enterodiol. No entanto, uma nova abordagem foi usada no presente trabalho, tendo como base a cultura de células em meio isento de soro. Neste contexto uma caracterização preliminar das células foi realizada, evidenciando que a cultura em meio sem soro conduz à diferenciação de um fenótipo cardíaco, com a activação da autofagia possivelmente tendo um papel no processo de diferenciação. Em relação à principal hipótese do trabalho, a lipotoxicidade cardíaca foi induzida pelo, de modo a mimetizar a acumulação de ácidos gordos nos cardiomiócitos. O efeito protector do 17β-estradiol, coumestrol e enterodiol, foi determinado pela proliferação de células utilizando o ensaio de SRB, alterações no potencial mitocondrial membranar por citometria de fluxo e, finalmente, pela detecção de marcadores de sinalização de autofagia usando Western Blot. Os resultados mostram de uma forma dependente da dose e tempo uma diminuição no número de células quando incubadas com PA, com um máximo efeito máximo para 100µM. Para os fitoestrogénios analisados, observou-se que concentrações não tóxicas apresentam toxicidade reduzida em cardiomioblastos. Além disso, mostrámos que o tratamento com coumestrol preveniu significativamente o efeito do PA nas células H9c2, aumentando o potencial de membrana mitocondrial, quando comparado com células tratadas com PA. Em conjunto, podemos concluir que o PA é um eficaz na lipotoxicidade e que o coumestrol e enterodiol apresentam toxicidade reduzida em células H9c2. Além disso, o coumestrol protege contra a toxicidade exercida pelo PA. No entanto, os mecanismos subjacentes a esta proteção são ainda desconhecidos. Uma vez que as mulheres apresentam elevados níveis de ácidos gordos no soro e um aumento do risco de doenças cardiovasculares durante a menopausa, é possível que o coumestrol possa ser utilizado para prevenir lipotoxicidade e reduzir o risco de doenças cardiovasculares em mulheres na menopausa.

Menopause is a natural biological process characterized by reduction of sex hormone levels, namely estrogen and progesterone. The loss of estrogens appears to trigger a cascade of downstream events, leading to increased risk for cardiovascular diseases (CVD). The conjugation of the aging process and loss of estrogen during menopause negatively impacts lipid metabolism in the heart, resulting in increased lipotoxicity and the risk for cardiovascular diseases. Structurally similar to 17β-Estradiol, phytoestrogens (PEs), plant-derived compounds displaying estrogenic and/or antiestrogenic activity, demonstrate a positive impact on CVD in several studies. The main objective of our study was to investigate if coumestrol and enterodiol, two promising PEs, are able to protect the cardiac tissue against lipotoxicity induced by free fatty acids. Estradiol was also used, as a positive control. The cell line H9c2 was used as an in vitro model for cardiac cells to investigate palmitic acid (PA)-induced lipotoxicity and the possible protection by coumestrol and enterodiol. However, a new approach was used in this study, based on cell culture in a serum-free medium. In this context a preliminary characterization of the cells was performed, showing that culture in serum-free medium leads to differentiation to a cardiac phenotype, with the activation of autophagy possibly having a role in the differentiation process. Regarding the main hypothesis of the present work, PA-induced cardiac lipotoxicity was used to mimic the accumulation of free fatty acids (FFA) in cardiomyocytes. The protective effect of 17β-estradiol, coumestrol and enterodiol, was determined by cell proliferation using the Sulforhodamine (SRB) assay, mitochondrial membrane potential alteration by flow cytometry and finally by detecting markers for autophagy signaling by Western Blotting. The results shows a dose- and time-dependent decrease in H9c2 cell mass when incubated with PA, with a maximal effect obtained for 100μM. For the PEs analyzed, we observed that non-toxic concentrations have reduced toxicity on H9c2 cardiomyoblasts. Moreover, we found that treatment with coumestrol significantly prevented the effect of PA on H9c2 cells, increasing the mitochondrial membrane potential when compared with cells treated with PA-treated cells. Altogether, we can conclude that PA is an effector of lipotoxicity and that coumestrol and enterodiol have reduced toxicity on H9c2 cells. Furthermore, coumestrol protects against the PA toxicity. However, the mechanisms underlying this protection are still largely unknown. Since women have elevated serum fatty acids and increased risk for CVD during menopause, it is possible that coumestrol can be used to prevent lipotoxicity and reduce the risk of CVD in the menopausal women.