The role of the Ubiquitin-Proteasome system and Autophagy in Tau clearance in primary neurons

Abstract

A acumulação intraneuronal e dendrítica da proteína associada aos microtúbulos Tau é uma característica proeminente de múltiplas desordens do sistema nervoso central, entre as quais a doença de Alzheimer, demência frontotemporal com parkinsonismo -17 e a doença de Pick [1-3]. Durante a progressão dessas doenças, normalmente a proteína Tau solúvel se combina formando oligômeros, que por sua vez se agregam formando os insolúveis emaranhados neurofibrilares e filamentos do neurópilo [1-3]. A ocorrência de inclusões fibrilares intraneurais de Tau nessas doenças sugere que elas possuam um papel nos sintomas clínicos e patologias observados, indicando um possível uso para terapias com a finalidade de degradar espécias tóxicas ou patológicas da Tau [1-3]. As células são equipadas com dois principais mecanismos para degradação protéica: o proteassoma e a autofagia [4-7]. Proteínas destinadas à degradação pelo proteassoma são ubiquitinadas e subsequentemente degradadas [8]. Estudos demonstraram que ambos o preteassoma completo 26S e o núcelo ativo 20S do proteassoma podem degradar a Tau recombinante [6, 9]. Além disto, atividade reduzida do proteassoma foi associada com envelhecimento e é comum em doenças neurodegenerativas [10]. Alternativamente, as células podem degradar proteínas e outros materiais celulares pela autofagia [7]. Proteínas degradadas pela autofagia são encapsuladas em autofagossomas, que são subsequentemente fundidos com lisossomas, culminando com degradação do seu conteúdo [7]. Há evidências de que agregados de Tau podem ser degradados pela autofagia, e a inibição desse processo resulta em níves de agregados de Tau aumentados, assim como toxicidade neuronal [6]. Consequentemente, a avaliação dos papéis do proteassoma e da autofagia na degradação de agregados da Tau in vitro é de grande importância. No presente estudo, nós otimizamos um modelo celular de agregação de Tau em neurônios no qual fibrilas pré-agregadas sinteticamente produzidas a partir de Tau recombinante (K18P301L) introduzidas nas células podem recrutar a Tau solúvel endógena transformando-a em agregados insolúveis, resultando em um modelo mais adequado a triagens de alta produtividade. Este modelo foi então utilizado como plataforma para caracterizar cineticamente as atividades do proteassoma e da autofagia em culturas primárias de neurônios mediante a indução da agregação da proteína Tau. Como resultado, nós demonstramos que a agregação da Tau induz ativação dependente do tempo do proteassoma e autofagia. Além da caracterização mencionada, os papéis do proteassoma e da autofagia foram avaliados a partir do uso de compostos de referência que inibem a atividade do proteassoma e induzem a atividade da autofagia, nomeadamente: MG132, Lactacistina e Rapamicina. A partir dessa abordagem farmacológica foi possível observar que a autofagia, quando induzida antes da indução da aggregação da proteína Tau, parece ter um papel importante na degradação da forma solúvel da Tau. Nossos resultados também sugerem que o proteassoma parece ser secundário na degradaçãdo da Tau, mas, apesar disso, pode estar trabalhando em conjunto com a autofagia, resultando na degradação de agregados da Tau. Essas observações são baseadas nos fatos de que a inibição do proteassoma não resultou em acumulação da Tau e de que a indução da autofagia resultou em degradação dos aggregados de Tau somente na presença de um proteassoma funcional. Por último, os nossos resultados preliminares da regulação negativa das enzimas OTUB1, USP5 e USP7, as quais interagem com a proteína Tau no cérebro de camundongo [11], indicam que nem a OTUB1 nem a USP5 parecem influenciar os níveis da Tau in vitro. Por outro lado, a regulação negativa da USP7 resultou em aumento da agregação da Tau, o que indica um possível papel dessa enzima de deubiquitinação na regulação da degradação da proteína Tau em culturas primárias de neurônios. Apesar de esse estudo ter sido um passo inicial importante para entender o papel do proteassoma e da autofagia na degradação da Tau in vitro, estudos adicionais para melhor mensurar a contribuição desses mecanismos de degradação são necessários. Considerando isso, estudos in vitro, nos quais as variáveis podem ser rigorosamente controladas, serão instrumentais devido à complexidade do ambiente celular. Fundamentalmente, uma compreensão mais completa da contribuição de cada um dos mecanismos de degradação protéica resultará em novas oportunidades para lidar terapeuticamente com a patologia da proteína Tau associada com a neurodegeneração em Tauopatias.

Intraneuronal and dendritic accumulation of the microtubule‐associated protein Tau is a prominent characteristic of multiple CNS disorders including Alzheimer's disease, frontotemporal dementia with Parkinsonism ‐17 (FTDP‐17) and Pick's disease [1-3]. During the progression of these diseases, normally soluble Tau combines to form oligomers, which then aggregate to form insoluble neurofibrillary tangles (NFTs) and neuropil threads [1-3]. The occurrence of intraneuronal fibrillar Tau inclusions in these diseases suggests they play a role in the observed clinical symptoms and pathology, and implies that therapies aimed at degrading toxic or pathologic Tau species may be of potential use [1-3]. Cells are equipped with two general mechanisms to degrade proteins: the ubiquitin–proteasome system and autophagy [4-7]. Proteins that are destined for degradation via the proteasome are ubiquitinated and subsequently broken down [8]. Previous studies have shown that both the complete 26S proteasome as well as the active 20S proteasome core can degrade recombinant Tau [6, 9]. Moreover, reduced proteasome activity is associated with aging and is common in neurodegenerative diseases [10]. Alternatively, cells may degrade proteins and cellular material via the process of autophagy [7]. Proteins targeted for degradation via autophagy are encapsulated in autophagosomes that are subsequently fused to lysosomes with their degradation as a final outcome [7]. There is evidence that Tau aggregates can be cleared through autophagy, and inhibition of autophagy leads to an increased level of aggregated Tau as well as neurotoxicity [6]. . Consequently evaluating the roles of the ubiquitin‐proteasome system and autophagy in the clearance of aggregated Tau in vitro is of major importance. In this study, we optimized a neuronal Tau aggregation cellular model wherein synthetic preaggregated fibrils made from recombinant protein (K18P301L) introduced into cells can recruit soluble endogenous Tau into insoluble fibrillar aggregates, making it more suitable for future High Throughput Screens. Such model was then used as a platform to kinetically characterize the UPS and autophagy activities in primary neurons upon Tau aggregation. Interestingly, we showed that Tau aggregation induce temporaldependent UPS and autophagy. We further validated the role of UPS and autophagy in Tau clearance by means of use of reference compounds known to inhibit UPS activity and to induce autophagy activity namely: MG132, Lactacystin and Rapamycin. By such pharmacological approach we could observe that autophagy seems to play a pivotal role in clearing soluble Tau species when induced, before Tau aggregation induction. Our results also suggest that UPS seems to be a secondary player in Tau clearance, but might be working together with autophagy resulting in aggregates clearance. Such observation is based on the results that upon UPS inhibition Tau accumulation did not occur and by the fact that only in the presence of a functional UPS induction of autophagy was able to clear aggregated Tau. Lastly, by knockingdown the deubiquitinating enzymes OTUB1, USP5 and USP7 that were shown to interact with Tau in the mouse brain [11], our preliminary results indicate that neither OTUB1 nor USP5 seem to influence Tau levels in vitro. On the other hand, USP7 ablation resulted in further Tau aggregation indicating a possible role of such DUB in regulating Tau degradation in primary neurons in vitro. Although this study made an important initial step toward elucidating the role of UPS and autophagy in Tau degradation in vitro, further studies that better gauge the contribution of each degradative pathway will be necessary. In view of this observation, in vitro studies that can tightly control for variables including Tau modifications and proteolytic pathway function will likely be instrumental due to the complexity of the cellular environment. Fundamentally, a more complete understanding of the differential contribution of various proteolytic and degradative pathways will provide critical opportunities for therapeutically addressing the Tau pathology associated with neurodegeneration in tauopathies.