Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/31069
Title: A novel MYO7A compound heterozygous mutation in an USH1 portuguese patiant : a translational multidisciplinary study
Authors: Monteiro, Nelson Cristóvão de Oliveira
Orientador: Silva, Filipe
Moreira, João Nuno Sereno de Almeida
Keywords: Síndrome de Usher; Gene MYO7A
Issue Date: 2015
Abstract: Usher syndrome is an autosomal recessive disease characterized by the association of retinitis pigmentosa and sensorineural hearing loss with or without vestibular dysfunction. Prevalence for this disease was estimated to be 3-4 per 100,000 individuals. Distinguished by clinical features, Usher syndrome can be divided in three types, where Usher syndrome type 1 is the most severe form. Causing disease mutations were reported in 10 genes, 6 of them associated to Usher syndrome type I. MYO7A gene is the most commonly mutated gene for this type, representing approximately 50% of the cases. MYO7A gene codes for myosin VIIa protein, previously described as a motor transport protein and participating in the establishment of cell-cell adhesions. This work aimed to evaluate the possibility of two novel MYO7A variants, identified in compound heterozygosity in a Usher syndrome type 1 Portuguese patient using a Targeted resequencing approach to 9 of the Usher syndrome associated genes, be responsible for the phenotype. Accordingly, the segregation analysis of these variants (c.3503+1delG and c.5561dupT) in the available patient relatives was performed, as well as the analysis of other five variants located between the two variant loci. Furthermore, 250 samples from normal individuals were analysed for the two novel variants and all of them presented the normal genotypes. Additionally, an in silico study was performed aiming to evaluate the evolutionary conservation of the two variant loci, revealing that the first is highly conserved among the mammalian analysed species while the second is highly conserved among the vertebrate analysed species. Since MYO7A c.3503+1delG variant is located at the donor splice site of MYO7A exon 27, alteration of splice site analysis was performed with in silico Splice site prediction and the complete absence of the normal donor splice site at MYO7A exon 27 was observed. Altogether, these results support the hypothesis that the two variants (c.3503+1delG and c.5561dupT) can be a compound heterozygous mutation responsible for Usher syndrome type I phenotype in the studied patient. In order to confirm the presence of the two variants in the MYO7A transcript nucleotide sequences, nasal epithelium samples from the patient and two normal individuals were studied and both wt and c.5561dupT alleles were expressed, while c.3503+1delG was only identified as the wt allele. However, it is predictable that a complex phenomenon be occurring at this splice site due to c.3503+1delG mutation. Finally, considering that it is x predictable that c.5561dupT mutation causes a MYO7A frameshift leading to a truncated myosin VIIa protein with a partially abnormal second MyTH4 domain and completely without the second FERM domain and the protein C-terminus, it seemed relevant to understand the effect of such mutation at the cellular and molecular level. Therefore, protein-protein interaction studies were performed with two constructions of C-terminal MyTH4-FERM (wt and mut), tagged with GFP. These studies suggested that the previously reported interaction of myosin VIIa with myrip was preserved in the presence of the MyTH4-FERM mut, and a gain of myosin VIIa function was achieved with the MyTH4-FERM mut, which seems to interact with munc13-4 protein, an interaction that was not seen with the MyTH4-FERM wt. Co-localization of both myosin VIIa with MyTH4-FERM mut and munc13-4 proteins was observed near vesicles structures when both were simultaneously expressed in HEK293a cells. This study reveals that MYO7A c.3503+1delG and c.5561dupT mutations are a compound heterozygous mutation causing USH1 in a Portuguese patient, and elucidate some functional myo7a protein alterations that may be important to understand the molecular mechanisms of this disease. However, further studies are required to clarify these implications at the cellular level.
O Síndrome de Usher é uma doença autossómica recessiva caracterizada pela associação de duas patologias, retinite pigmentosa e da perda auditiva sensoneural, às quais poderá estar também associada uma disfunção vestibular. Estima-se que esta doença afecta 3 a 4 indivíduos em cada 100 000. Distinguidos pelas características clínicas, o Síndrome de Usher pode ser dividido em três tipos, de entre os quais o Síndrome de Usher do tipo 1 é a forma mais severa. Até à data foram identificados 10 genes que possuem mutações causadoras desta doença, 6 dos quais foram associados ao Síndrome de Usher do tipo 1. O gene MYO7A é o gene onde foram encontradas mais mutações em doentes com este tipo de síndrome, representando cerca de 50% dos casos. O gene MYO7A codifica uma proteína designada de miosina VIIa, a qual já foi previamente descrita como uma proteína transportadora que também está envolvida no estabelecimento de adesões intercelulares. Este trabalho tem por objectivo avaliar a possibilidade de duas novas variantes do gene MYO7A serem responsáveis pelo fenótipo do Síndrome de Usher do tipo 1. Estas duas novas variantes foram identificadas em heterozigotia composta num doente português com Síndrome de Usher do tipo 1, através de uma abordagem de Targeted resequecing para 9 dos genes associados ao Síndrome de Usher. Assim sendo, foi feita a análise não só destas variantes (c.3503+1delG e c.5561dupT) mas também de outras cinco variantes localizadas entre entes loci, nos familiares em que foi possível. Além disso, as duas novas variantes foram analisadas em 250 amostras provenientes de indivíduos saudáveis, sendo que não foram encontradas em nenhuma destas amostras. Para além disso, com o objectivo de avaliar a conservação evolutiva destes loci foram realizados estudos in silico que demonstraram que ambos os loci são extremamente conservados entre as espécies de mamíferos analisadas. Uma vez que a variante c.3503+1delG do gene MYO7A está localizada no donor splice site do seu exão 27, foi feita uma previsão da alteração do local de splicing com um softweare online (splice site prediction), previsão esta que revelou uma completa destruição deste local de splicing na presença desta variante. Todos estes resultados sustentam a hipótese de que estas duas variantes (c.3503+1delG e c.5561dupT) possam constituir uma mutação heterozigótica composta responsável pelo fenótipo do Síndrome de Usher do tipo 1 no doente estudado. Com o intuito de perceber se estas duas novas variantes estariam alteradas na sequência de nucleótidos do transcrito do gene MYO7A, foram utilizadas uma amostra do epitélio nasal do doente e duas amostras do epitélio nasal de dois indivíduos normais, tendo xii sido verificada a expressão quer do alelo normal quer do alelo com a variante c.5561 na amostra do doente. No que diz respeito à variante c.3503+1delG, apenas foi possível identificar o alelo selvagem. Contudo, é espectável que na presença desta mutação possa estar a ocorrer um fenómeno complexo. Por último, considerando a probabilidade que a mutação c.5561dupT cause uma frameshift no transcrito do gene MYO7A, originando uma miosina VIIa truncada com um segundo domínio MyTH4 parcialmente anómalo que leva à destruição completa do segundo domínio FERM e do C-terminal da proteína, é relevante elucidar quais os efeitos desta mutação ao nível celular. Posto isto, foram realizados estudos de interacção proteína-proteína com duas construções dos domínios MyTH4-FERM do terminal carboxílico (selvagem e mutada) com uma tag de GFP. Estes estudos sugerem que a interacção já descrita entre a miosina VIIa e a myrip foi preservada na presença da mutação. Para além disso, foi identificado aquilo que parece ser um ganho de função por parte destes domínios do terminal carboxílico da miosina VII. Na presença da mutação, observou-se interacção com a munc13-4, o que não é detectado na presença destes domínios na sua forma selvagem. A ocorrência desta interacção e de um possível ganho de função na presença da mutação por parte da miosina VIIa é suportado pela observação da co-localização da muc13-4 e dos domínios do terminal carboxílico da miosina VIIa mutada perto de estruturas que se assemelham a vesículas, quando ambas são expressas nas células HEK293a. Este estudo revela que as mutações c.3503+1delG e c.5561dupT do gene MYO7A constituem uma mutação heterozigótica composta que é causa do fenótipo de Síndrome de Usher do tipo 1 num doente Português. Para além disso, elucida algumas alterações da miosina VIIa que podem ser importantes para elucidar os mecanismos moleculares desta doença. Contudo, mais estudos serão necessários para clarificar estas implicações ao nível celular
Description: Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/31069
Rights: embargoedAccess
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