Evaluation of the interplay between polymorphisms in enzymes from one-carbon metabolism and Myelodysplastic syndromes = Avaliação da relação entre polimorfismos em enzimas envolvidas no ciclo do carbono e a síndrome Mielodisplásica

Abstract

O cancro é uma das maiores causas de morte a nível mundial, prevendo-se que o número de novos casos supere os 24 milhões nas próximas duas décadas. O processo pelo qual as células adquirem propriedades cancerígenas é atualmente considerado como sendo dependente da aquisição de mutações, cujas consequências se traduzem em danos no genoma. O tipo de mutação mais comum é o que envolve a substituição de um nucleótido que, quando tem apresenta uma frequência de pelo menos 1% na população, é denominado polimorfismo de nucleótido único (SNP, do inglês single nucleotide polymorphism). Dependendo da região em que ocorre e da alteração funcional ao qual pode estar associado, o SNP pode conferir tanto um efeito protector como um factor de risco aumentado para o desenvolvimento de doença. A síndrome mielodisplásica (SMD) é um conjunto de doenças relacionadas com o sistema hematopoiético, caracterizada por uma hematopoiese ineficaz, displasias, e ainda uma susceptibilidade acrescida para o desenvolvimento de leucemia mieloide aguda (LMA). A transcrição de genes supressores tumorais, como é o caso do P15 e do P16, pode ser inactivada pela metilação aberrante da região promotora, nomeadamente das ilhas CpG, o que tem adquirido especial interesse em neoplasias hematológicas, em particular na SMD. Nutrientes provenientes da dieta, como é o caso do folato e da vitamina B12 podem influenciar a produção de grupos metil e, consequentemente, o processo de metilação. Para além disso, a SMD parece estar relacionada com SNPs em enzimas que regulam o ciclo do carbono, o mecanismo responsável tanto pela metilação do DNA como pela síntese de nucleótidos. Uma vez que a hipometilação global e a hipermetilação localizada do DNA são características de tumores humanos, incluindo a SMD, e o suprimento de folato está associado a estas características, foi colocada a hipótese de que polimorfismos em genes que intervêm neste ciclo, nomeadamente os genes MTR, SCL19A1, MTRR e CBS, podem afectar o estado de metilação do DNA e, assim, influenciar não só o desenvolvimento de SMD, como a progressão da doença para LMA. Neste sentido, o principal objectivo deste trabalho foi a avaliação da relação entre os polimorfismos genéticos associados aos genes MTR (rs1805087 e rs2229276), SLC19A1 (rs1051266), MTRR (rs162036) e CBS (844ins68), que regulam o ciclo do carbono, e o risco associado ao desenvolvimento de SMD. Analisamos ainda a influência das variantes x polimórficas nos níveis de folato e vitamina B12, bem como o seu papel no grau de metilação das sequências LINE-1 e dos genes P15 e P16. Para isto, foram genotipadas as amostras de 77 doentes e 80 controlos não neoplásicos, para cada um dos genes em estudo. Os genótipos associados aos genes MTR e MTRR foram obtidos através da técnica ARMS-PCR, tendo sido utilizada a técnica de RFLPPCR para a análise do gene SLC19A1 e o PCR convencional para o gene CBS. O grau de metilação da sequência LINE-1 foi avaliado por ensaios COBRA e a frequência de metilação dos genes P15 e P16 foi obtida pela realização da técnica MS-PCR. Posteriormente, foi avaliada a força de associação entre as variantes polimórficas e o risco de desenvolvimento de SMD, através do cálculo do risco relativo por análise de regressão logística. Avaliou-se ainda a relação entre os polimorfismos genéticos, a progressão da doença para LMA e a sobrevivência global dos doentes, com recurso a regressão logística e análise de Kaplan-Meier. De seguida, analisou-se a possibilidade de o risco para o desenvolvimento de SMD ser influenciado pelos perfis génicos ou haplotipos. Por fim, o teste exacto de Fisher foi usado ara avaliar relação entre as variantes polimórficas e o grau de metilação dos genes P15 e P16 e a sequência LINE-1. Da avaliação dos polimorfismos no risco de desenvolvimento da doença, observámos que o genótipo GG do variante rs2229276 associada ao gene MTR pode constituir um factor protector para o desenvolvimento de SMD (OR=0.29) e que a presença do alelo G parece estar relacionada com uma menor predisposição para a doença (OR=0.33). No que diz respeito à associação entre as variantes polimórficas e a presença ou ausência de alterações citogenéticas, o genótipo heterozigótico (WT-Ins) do gene CBS (844ins68) mostrou-se relevante em indivíduos com cariótipo normal para as alterações mais comuns na SMD (OR=0.22). Pela análise das curvas de Kaplan-Meier, observou-se que os indivíduos portadores do genótipo AG para o polimorfismo rs162036 do gene MTRR apresentam um aumento da progressão da doença para LMA, bem como uma tendência, embora sem significado estatístico, para uma diminuição da sobrevivência dos doentes. Para além disso, a avaliação dos níveis de vitamina B12 parece estar relacionada com o genótipo GG do gene MTR (rs2229276). Em relação ao polimorfismo rs1051266 relativo ao transportador SLC19A1, este parece influenciar o estado de metilação do gene P16 nos doentes com SMD (OR=3.80). xi Os resultados deste estudo permitem-nos concluir que a presença de variantes polimórficas desempenha um papel importante na SMD e realçam a importância do estudo de genes envolvidos no ciclo do carbono na patogénese desta doença

Cancer is a leading cause of death worldwide, predicted to rise more than 24 million new cases globally in the next two decades. The process by which normal cells become progressively transformed into malignant derivatives is now known to require the acquisition of mutations, which arise as a consequence of damage to the genome. The most common mutational change is associated with the substitution of a single nucleotide, called single nucleotide polymorphism (SNP) when its frequency on the population is, at least, of 1%. Depending on the region where it occurs and the functional changes that it may cause, a SNP may confer a protective effect or modulate an increased susceptibility to disease development. Myelodysplastic Syndrome (MDS) is a family of clonal hematopoietic stem cells disorders that involves a multistep pathogenesis characterized by dysplasia, innefective hematopoiesis and susceptibility to transformation into Acute Myeloid Leukemia (AML). Transcriptional inactivation of tumor suppressor genes, such as P15 and P16, by promoter CpG island hypermethylation has been subject of interest in haematological malignancies, namely in MDS. Dietary factors such as folate and vitamin B12 could influence the supply of methyl groups and, therefore the biochemical pathways of methylation processes. Moreover, MDS is thought to be associated with SNPs in enzymes from one-carbon metabolism, the pathway that is responsible for DNA methylation and nucleotide synthesis. Since global hypermethylation and targeted hypomethylation are considered defining characteristics of human tumours, including MDS, and folate depletion in certain human cells lines can result in global hypomethylation and also targeted hypermethylation, we hypothesized that genetic variability in 1-carbon metabolism, namely in MTR, SLC19A1, MTRR and CBS genes, can affect the methylation status and contribute, not only to MDS development, but also to progression to AML. In this context, our major goal was to evaluate the interplay between genetic polymorphisms in enzymes involved in the folate mechanism, namely MTR rs1805087 and rs2229276, SLC19A1 rs1051266, MTRR rs162036 and CBS 844ins68, and the risk of developing MDS. Furthermore, we assessed the influence of these genetic polymorphisms in folate and vitamin B12 levels in MDS patients, as well as the role of gene variants in the degree of P15, P16 and LINE-1 methylation. To this end, we genotyped 77 MDS patients and 80 healthy xiv controls, assessing ARMS-PCR for MTR and MTRR genes, RFLP-PCR for determining the variants for SLC19A1, and conventional PCR for detecting CBS variants. P15 and P16 methylation status were obtained by MS-PCR, while LINE-1 level of methylation was performed by COBRA assay. Posteriorly, we evaluated the strength of association between polymorphic variants and the development of MDS by calculating the associated odds ratio, through logistic regression analysis. We also evaluated the relation between genetic profiles, evolution to AML and overall survival in MDS patients, by logistic regression and Kaplan-Meier curves analysis. Next, we investigated the influence of genetic profiles and haplotypes on the risk of MDS development. The influence of genetic polymorphisms on P15, P16 and LINE-1 methylation was performed using Fisher’s exact test. Concerning odds ratio for risk disease, our main results revealed that AG genotype from MTR rs2229276 is a protector factor for the development of MDS, presenting a 0.29- fold decreased associated risk. Adittionally, the G allele also proved to have a protector effect on MDS, with a 0.33-fold decreased risk on disease development. In relation to cytogenetic alterations, the CBS 844ins68 WT-Ins genotype was found to be significantly associated with the absence of the most common cytogenetic abnormalities in MDS (OR=0.22). Subsequently, the analysis of Kaplan-Meier curves showed that heterozygous (AG) individuals for MTRR rs162036 not only presented a significant increase to AML evolution (p=0.049), but also show a tendency to be associated with a worse overall survival. In relation to folate and vitamin B12 levels, only vitamin B12 proved to be influenced by polymorphisms, in this case, by GG genotype from MTR rs2229276 variant (p=0.039). The odds ratio relating P15 and P16 methylation and genetic variants showed that GG genotype from SLC19A1 rs1051266 negatively influences P16 methylation in MDS patients (OR=3.80). The results of this study allow us to accomplish that polymorphisms play important roles in MDS and highlight the importance of the study of one-carbon metabolism in the pathogenesis of the disease