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Title: Can DPP-IV Inhibitors or GLP-1 Analogs be Tomorrow’s Therapy for Diabetic Retinopathy?
Authors: Gonçalves, Andreia Fernandes Dâmaso 
Orientador: Fernandes, Rosa
Ambrósio, António Francisco
Keywords: Barreira hemato-retiniana; Exendina-4; Inflamação; Retinopatia diabética; Sitagliptina; Blood-retinal barrier; Diabetic retinopathy
Issue Date: 30-Sep-2016
Citation: GONÇALVES, Andreia Fernandes Dâmaso - Can DPP-IV inhibitors or GLP-1 analogs be tomorrow’s therapy for diabetic retinopathy? : Coimbra : [s.n.], 2016. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/30614
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/COMPETE/125980/PT 
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/COMPETE/132965/PT 
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876/147358/PT 
Abstract: A retinopatia diabética é uma das complicações associadas à diabetes e uma das principais causas de perda de visão na população em idade ativa em todo o mundo. No entanto, os tratamentos disponíveis para esta doença são escassos, invasivos, não eficazes para todos os doentes, apresentam alguns riscos adversos e são normalmente administrados nas fases tardias da retinopatia diabética, quando a visão já se encontra significativamente comprometida. Desta forma, novas estratégias terapêuticas instituídas nos estadios iniciais da retinopatia diabética poderão ser efetivas para retardar ou atenuar a progressão da doença, prevenindo a perda de visão. Terapias antidiabéticas baseadas nas incretinas, os inibidores da dipeptidil-peptidase-IV (DPP-IV) e os agonistas do recetor do peptídeo semelhante ao glucagão (GLP-1), melhoram o controlo glicémico em doentes com diabetes do tipo 2 através do aumento da secreção de insulina. Estudos anteriores do nosso laboratório demonstraram que a sitagliptina (um inibidor da DPP-IV) previne o stresse nitrosativo, a inflamação e a apoptose das células da retina, exercendo ainda efeitos protetores ao nível da barreira hemato-retiniana (BHR) e melhorando o controlo glicémico num modelo animal de diabetes do tipo 2. Até ao início deste trabalho a informação existente sobre os efeitos diretos das terapias baseadas na modulação das incretinas na retina diabética era escassa. Nesse contexto, o principal objetivo da primeira parte deste trabalho foi investigar os efeitos da sitagliptina, independentes do seu efeito insulinotrópico, na retina diabética. Para tal foi usado um modelo animal de diabetes do tipo 1 induzida por estreptozotocina. O tratamento com sitagliptina (5 mg/kg/dia) foi iniciado após duas semanas de diabetes e prolongou-se por mais duas semanas, não se tendo observado qualquer efeito nos níveis de glicemia ou de insulina nos animais diabéticos. A sitagliptina preveniu o aumento da atividade e dos níveis da enzima DPP-IV no soro e na retina, induzido pela diabetes. A sitagliptina preveniu o aumento da permeabilidade da BHR, bem como alterações das proteínas das junções oclusivas induzidas pela diabetes. Além disso, a sitagliptina preveniu o aumento dos níveis da citocina pró-inflamatória interleucina-1β e da molécula de adesão intercelular-1 nas retinas diabéticas. A sitagliptina preveniu ainda o aumento dos níveis da proteína pró-apoptótica Bax, o aumento do número de células positivas a TUNEL e a degenerescência de células neuronais nas retinas diabéticas. Os resultados obtidos demonstram que a sitagliptina previne eficazmente a rutura da BHR e algumas das alterações que contribuem para a disfunção da BHR nas fases iniciais da retinopatia diabética, tais como a inflamação e a morte celular. Uma vez que o mecanismo de ação proposto para a sitagliptina baseia-se no aumento dos níveis endógenos do GLP-1, pretendeu-se esclarecer se os efeitos benéficos da sitagliptina nas retinas diabéticas foram, de alguma forma, mediados pelo GLP-1. Com a finalidade de esclarecer essa questão, na segunda parte deste estudo, foram avaliados os potenciais efeitos benéficos de um agonista do recetor do GLP-1, a Exendina-4 (Ex-4), contra a rutura da BHR e inflamação. Foi usado um modelo animal de isquemia-reperfusão (IR) que apresenta alterações semelhantes às observadas na retinopatia diabética. A IR ocular foi induzida em ratos através do aumento da pressão intra-ocular durante 45 min seguido de 48 h de reperfusão. O tratamento com Ex-4 (10 µg/kg) (duas administrações iniciais antes da isquemia e depois a cada 12 h durante o período de reperfusão) preveniu o aumento da permeabilidade vascular da retina induzido por IR. No entanto, estudos in vitro utilizando culturas primárias de células endoteliais da retina mostraram que o Ex-4 não preveniu o aumento da permeabilidade induzido por agentes permeabilizantes. O Ex-4 inibiu ainda a expressão de vários genes inflamatórios nas retinas de ratos sujeitos a IR. Em cultura de células da microglia, o Ex-4 reduziu a resposta inflamatória ao lipopolissacarídeo, muito provavelmente devido à inibição do fator nuclear-kB e à ativação do CREB. Além disso, a inibição da ativação das células da microglia foi capaz de proteger contra a disfunção da barreira de células endoteliais. Este estudo sugere que o Ex-4 previne a rutura da BHR e a inflamação induzidas por IR através da inibição da produção de citocinas inflamatórias pelas células da microglia. Em resumo, estes resultados oferecem uma nova perspetiva sobre os efeitos protetores das terapias baseadas nas incretinas contra a disfunção da BHR, inflamação e apoptose das células da retina. Com este trabalho foi ainda possível desvendar um novo mecanismo que ajuda a explicar os benefícios destas terapias na retinopatia diabética, isto é, a modulação da resposta pró-inflamatória nas células da microglia. Este trabalho contribui ainda para ajudar a criar condições para a utilização destas terapias não só para a retinopatia diabética, mas como para outras patologias oculares caraterizadas por um aumento da permeabilidade vascular e inflamação.
Diabetic retinopathy, a major complication of diabetes, is a leading cause of vision loss and blindness in working-age population worldwide. However, the treatments available are scarce, invasive, inefficient to a high percentage of patients, present some adverse risks, and are typically targeted for the later stages of diabetic retinopathy, when vision has already been significantly affected. Therefore, novel therapeutic approaches targeting the early stages of diabetic retinopathy could slow down the progression of the disease, being protective against vision loss. Incretin-based antidiabetic agents, the dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV) inhibitors and glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor agonists, improve glycemic control by increasing insulin secretion in patients with type 2 diabetes. We have previously demonstrated that the DPP-IV inhibitor sitagliptin prevents nitrosative stress, inflammation and apoptosis in retinal cells and exerts beneficial effects on the blood-retinal barrier (BRB), while improving glycemic control in an animal model of type 2 diabetes. When this work started, the available information about the direct effects of incretin-based therapies in the diabetic retina was scarce. In this context, the main purpose of the first part of this work was to investigate the insulinotropic-independent effects of sitagliptin in the diabetic retina, by using an experimental model of streptozotocin-induced type 1 diabetes. Treatment with sitagliptin (5 mg/kg/day) started after two weeks of diabetes and lasted for two additional weeks. Sitagliptin treatment did not affect glycemia or insulin levels in diabetic animals. Sitagliptin prevented the diabetes-induced increase in both DPP-IV activity and DPP-IV levels in serum and retina. Sitagliptin prevented the increase of BRB permeability as well as alterations in tight junction proteins induced by diabetes. Furthermore, sitagliptin was able to prevent the upregulation of the pro-inflammatory cytokine interleukin-1β and the intercellular adhesion molecule-1 in the diabetic retinas. Sitagliptin also prevented the upregulation of the pro-apoptotic protein Bax, the increase in the number of TUNEL-positive cells and degenerating neuronal cells in the retina of diabetic animals. Altogether, these data show that sitagliptin is efficient in preventing BRB breakdown and associated features, such as inflammation and cell death, which are known to underlie and contribute to BRB dysfunction in the early stages of diabetic retinopathy. Since the proposed mechanism of action of sitagliptin lies in increasing the endogenous levels of GLP-1, we further aimed to elucidate whether the beneficial effects of sitagliptin in the diabetic retinas were somehow mediated by GLP-1. To clarify this issue, in the second part of this study, the potential beneficial effects of a GLP-1 receptor agonist, Exendin-4 (Ex-4), against BRB breakdown and inflammation were evaluated. For this purpose, an animal model of ischemia-reperfusion (IR) injury, presenting alterations known to occur in diabetic retinopathy, was used. Ocular IR injury was induced in rats by increasing the intraocular pressure for 45 min followed by 48 h of reperfusion. Ex-4 (10 µg/kg) treatment (two initial administrations prior to ischemia and then every 12 h for the next 48 h during the reperfusion period) was able to prevent the increase in retinal vascular permeability triggered by IR injury. However, in vitro studies, using primary cultures of retinal endothelial cells, showed that Ex-4 fails to prevent the increase in permeability triggered by permeabilizing agents. Ex-4 also inhibited the expression of IR-responsive inflammatory genes in the rat retinas. In cultured microglial cells, Ex-4 decreased the inflammatory response to lipopolysaccharide, most likely due to inhibition of nuclear factor-κB and CREB activation. Furthermore, inhibition of microglia activation was able to protect against endothelial cell barrier dysfunction in vitro. This study suggests that Ex-4 can prevent IR injury induced-BRB breakdown and inflammation through inhibition of inflammatory cytokine production by activated microglia. The results presented herein provide a new insight into the protective effects of incretin-based therapies against BRB breakdown, inflammation and retinal cell apoptosis. Additionally, this work reveals a new mechanism that helps explaining the benefits of the incretin-based therapies in diabetic retinopathy, i.e., : the modulation of the pro-inflammatory response in microglial cells. Moreover, this work helps to envisage these therapies for diabetic retinopathy, as well as for other ocular pathologies characterized by increased vascular permeability and inflammation.
Description: Tese de doutoramento em Engenharia Biomédica, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/30614
Rights: openAccess
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