Quantitative characterization of vascular formations in vitro and in vivo

Abstract

Angiogenesis, the process by which new blood vessels grow from existing ones, plays a crucial role not only in normal physiological conditions but also on the progression of several diseases such as cancer, rheumatoid arthritis and diabetic retinopathy. Therefore, a better understanding of the cellular, molecular and mechanical events involved in angiogenesis is of utmost importance. Quantitative mathematical models for angiogenesis constitute a valuable tool in the prediction of vascular growth, and may provide a powerful instrument to design new therapeutic solutions. Despite its putative biological and pathophysiological relevance, the currently repository of validated quantitative data that can be directly used to parameterize predictive mathematical models of angiogenesis is scarce. The best characterized player in the stimulation of angiogenesis is Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). Indeed, this growth factor has been extensively described as a general activator of endothelial cells (ECs) proliferation, migration and activation of tip cell phenotype. Additionally, VEGF has been associated with vasodilation of the existing vessels an increased permeability of the vessel wall. Therefore, the aim of this work was to characterize and quantify the influence of VEGF in angiogenesis. For this purpose, we started by determining the influence of initial cell density in proliferation rates of HMEC. The results obtained show that regardless the initial cell density, cells have an exponential growth. Furthermore we established the basal rate of VEGF secretion and consumption, by ECs, as well as its influence in the cell proliferation rate. By measuring the amount of VEGF over time, either in the presence or absence of externally added VEGF, we concluded that regardless the amount of VEGF added to the medium, after an initial decrease in the concentration of VEGF remains approximately constant in time and also that VEGF concentrations necessary to trigger a proliferative response in the ECs are superior to the range of their own production. Furthermore the isolation of other external stimuli besides VEGF, by depletion of serum from the culture medium, shows that addition of VEGF triggers a rapid cell growth in an initial stage, after which the cell growth decreases, suggesting that VEGF by itself is not enough to sustain ECs proliferation. In addition to the initial trigger, modifications in the levels of VEGF during angiogenesis can model the behaviour of ECs, including sprouting and determine the final structure of the vascular network. Indeed sprouting is strongly dependent on VEGF. Our sprouting assays show that, depending on its concentrations, VEGF can induce sprouting or proliferation. Indeed our data demonstrate that for low concentrations of VEGF, sprouting is stimulated, whereas for higher concentrations proliferation seems to be dominant over EC sprouting. To validate the data obtain in vitro we also analysed vascular formation in in vivo matrigel assays as a function of the concentration VEGF. The results obtained show that higher concentrations of VEGF results into more and larger calibre vessels, that in pathological conditions often leads to the formation of abnormal and leaky vessels. However our results show well-formed vessels and absence of leakage, leading us to conclude that the VEGF concentrations used allow the formation of a reliable and functional vasculature. In summary, the data gathered in this work allowed the parameterization of VEGF influence on processes essential for angiogenesis including cell proliferation, migration, sprouting and new blood vessel formation. Moreover, these results will allow the improvement of the mathematical model for angiogenesis, in terms of accuracy and predictability. Thus, this study may open new perspectives regarding the evaluation of the factors that might be involved in abnormal vessel formation usually associated with pathological conditions, providing a powerful tool to design new therapeutical strategies in vascular biology.

A angiogénese, processo pelo qual se formam novos vasos sanguíneos a partir de outros já existentes, desempenha um papel crucial não apenas em condições fisiológicas, mas também na progressão de diversas patologias tais como cancro, artrite reumatóide e retinopatia diabética. Desta forma, uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos na angiogénese é de extrema relevância. Os modelos matemáticos da angiogénese constituem uma ferramenta valiosa na previsão do crescimento vascular, em órgãos e tecidos sujeitos a diversos estímulos ou insultos, podendo, desta forma contribuir para o desenho de novas abordagens terapêuticas, dirigidas especificamente a alvos ou factores potencialmente identificados e descritos no modelo. Apesar da potencial relevância destes modelos, os dados quantitativos validados, que podem ser usados directamente para os parametrizar são escassos. São muitos os factores que estimulam e intervêm durante o processo de angiogénese, sendo o principal o Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF). Na verdade, este factor de crescimento tem sido amplamente descrito como responsável pela proliferação, migração e activação do fenótipo de tip cell nas células endoteliais (EC). Para além disso, o VEGF tem sido também associado a vasodilatação e aumento da permeabilidade de vasos já existentes, podendo desta forma contribuir para o complexo fenótipo de doença vascular. Assim, o principal objectivo deste trabalho foi caracterizar e quantificar o papel do VEGF na angiogénese. Para este efeito, numa primeira fase, começou-se por determinar a influência da densidade celular inicial na taxa de proliferação das ECs. Os resultados obtidos mostram que, independentemente da densidade inicial de células, estas seguem um crescimento exponencial. Além disso, foi determinada a taxa basal de secreção e consumo de VEGF, pelas ECs, bem como a sua influência na taxa de proliferação celular. Ao medir a quantidade de VEGF ao longo do tempo, quer na presença ou ausência de VEGF externo, concluiu-se que, independentemente da quantidade de VEGF adicionada ao meio, após uma diminuição inicial, a concentração deste mantém-se aproximadamente constante ao longo do tempo. Os resultados mostram também que as concentrações de VEGF necessárias para desencadear uma resposta proliferativa em ECs são superiores às suas taxas de produção. Por outro lado, a exclusão de outros estímulos externos, além do VEGF, alcançada pela depleção de soro do meio de cultura, mostra que a adição de VEGF provoca, numa fase inicial, um rápido crescimento celular, após o qual o crescimento celular diminui, sugerindo que o VEGF por si só não é suficiente para sustentar a proliferação das ECs. Para além da proliferação, alterações dos níveis de VEGF durante a angiogénese podem modelar o comportamento das ECs, incluindo sprouting, que pode, por sua vez, condicionar a estrutura final da rede vascular. Os nossos ensaios de sprouting mostram que, dependendo da concentração em que está presente, o VEGF pode induzir sprouting ou proliferação das ECs. De facto os nossos dados demonstram que com baixas concentrações de VEGF, o sprouting é estimulado, no entanto quando presente em concentrações mais elevadas, a proliferação parece ser dominante sobre o processo de sprouting. Para validar os dados obtidos in vitro, analisamos a formação de estruturas vasculares em ensaios in vivo em função da concentração de VEGF. Os resultados obtidos mostram que concentrações mais elevadas de VEGF resultam em mais vasos e de maior calibre, que, frequentemente levam, em condições patológicas, à formação de vasos anormais e de elevada permeabilidade. Contudo, os nossos resultados mostram estruturas vasculares bem formadas e ausência de extravasamento, levando-nos a concluir que as concentrações de VEGF usadas permitem a formação de uma vasculatura funcional e fiável. Em resumo, os dados recolhidos neste trabalho vão permitir a parametrização da influência VEGF em processos essenciais para a angiogénese, incluindo a proliferação celular, migração, sprouting e formação de novos vasos sanguíneos. Além disso, estes resultados contribuem para melhorar os parâmetros matemáticos usados no modelo de angiogénese, permitidno, desta forma, aumentar a sua precisão e poder de previsibilidade. Assim, este estudo pode abrir novas perspectivas na avaliação da influência de factores que podem estar envolvidos na formação de vasos anormais geralmente associada a condições patológicas, fornecendo uma ferramenta poderosa para projectar novas estratégias terapêuticas na biologia vascular.