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Title: Controlling neuroinflammation in the retina through A2AR modulation: potential therapeutic implication in glaucoma
Authors: Madeira, Maria Helena Bica
Orientador: Santiago, Ana Raquel
Ambrósio, António F.
Keywords: Adenosine
Glaucoma
Microglia
Retina
Neuroinflammation
Neuroprotecction
Issue Date: 22-Jun-2016
Citation: MADEIRA, Maria Helena Bica - Controlling neuroinflammation in the retina through A2AR modulation : potential therapeutic implication in glaucoma. Coimbra : [s.n.], 2016. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/30470
Abstract: O glaucoma é a segunda causa de perda de visão em todo o mundo, sendo caracterizado por danos no nervo ótico e morte de células ganglionares da retina. A ativação precoce e exacerbada das células da microglia, as células imunocompetentes do sistema nervoso central, e a resposta neuroinflamatória foram também descritas em glaucoma, e pensa-se que podem estar envolvidas nos processos que conduzem à morte das células ganglionares da retina. A idade avançada e o aumento da pressão intraocular são considerados os principais fatores de risco para desenvolver esta doença. Atualmente, os tratamentos existentes baseiam-se na diminuição da pressão intraocular. Contudo, em muitos doentes a doença continua a progredir apesar de um controlo efetivo da pressão intraocular. Por isso, o desenvolvimento de novas estratégias, direcionadas à proteção das células ganglionares da retina, pode oferecer um potencial tratamento para o glaucoma. A adenosina é um neuromodulador essencial no sistema nervoso central, cujos níveis aumentam em condições nocivas. A adenosina atua em recetores purinérgicos do tipo P1: recetores A1 e A3 (inibitórios) e recetores A2A e A2B (facilitatórios). Antagonistas do recetor A2A de adenosina (A2AR) surgiram como potenciais agentes neuroprotetores em doenças cerebrais neurodegenerativas, nomeadamente através do controlo da resposta neuroinflamatória mediada por células da microglia. Tendo em conta o contributo da neuroinflamação mediada pelas células da microglia no desenvolvimento de glaucoma, neste trabalho o principal objetivo foi avaliar a contribuição do bloqueio do A2AR no controlo da resposta neuroinflamatória na retina e os seus potenciais efeitos neuroprotetores nas células ganglionares da retina, usando para isso modelos in vitro e animais de glaucoma. Na primeira parte deste trabalho, culturas organotípicas de retina foram expostas a um estimulo inflamatório com lipopolissacarídeo (LPS; 3 μg/mL), ou a pressão hidrostática elevada (70 mmHg acima da pressão atmosférica normal), para mimetizar a hipertensão ocular, na presença ou ausência de um antagonista seletivo do A2AR, SCH 58261 (50 nM). Após exposição a LPS ou a pressão hidrostática elevada ocorreu um aumento da expressão do A2AR, em paralelo com aumento da reatividade das células da microglia e da expressão de mediadores pró-inflamatórios, assim como uma redução do número de células ganglionares da retina. O bloqueio do A2AR preveniu a resposta neuroinflamatória induzida pelos dois estímulos, assim como a reatividade das células da microglia. Além disso, o tratamento com SCH 58261 preveniu a perda de células ganglionares da retina, um efeito que foi também observado na presença de anticorpos anti-fator de necrose tumoral (TNF) e anti-interleucina-1β (IL-1β). Estes resultados sugerem que o bloqueio do A2AR previne a perda de células ganglionares da retina através do controlo da resposta neuroinflamatória da retina. De forma a elucidar o efeitos diretos do bloqueio do A2AR no controlo da reatividade das células da microglia da retina, na segunda parte deste trabalho, culturas primárias de microglia de retina, foram expostas a LPS ou pressão hidrostática elevada, após pré-tratamento com SCH 58261 (50 nM). Semelhante ao que observamos nas culturas organotípicas de retina, o bloqueio do A2AR preveniu a ativação destas células induzidas por LPS ou pressão hidrostática elevada, nomeadamente a expressão de marcadores inflamatórios como TNF e IL-1β ou monóxido de azoto (NO). A atividade fagocítica das células microglia induzida por LPS foi também prevenida pelo antagonista do A2AR. Adicionalmente, num modelo animal de pressão intraocular elevada induzida por isquémia-reperfusão (I-R), a injeção intravítrea de SCH 58261 (100 nM; 5 μL) reduziu a resposta neuroinflamatória induzida por I-R e a perda de células ganglionares da retina. De facto, a injeção de anticorpos contra TNF e IL-1β mimetizou os efeitos do antagonista do A2AR, suportando assim a hipótese de que o bloqueio do A2AR confere proteção às células ganglionares da retina ao reduzir a resposta neuroinflamatória mediada pelas células da microglia. A cafeína é um antagonista dos recetores de adenosina que confere neuroproteção no cérebro, através dos efeitos antagonísticos no recetor A2AR. Por isso, na terceira parte deste trabalho, investigámos o efeito da administração de cafeína (1 g/L, em água) num modelo animal de hipertensão ocular, induzida por fotocoagulação a laser das veias perilimbares. A administração de cafeína reduziu parcialmente a pressão intraocular em animais com hipertensão ocular, contudo este efeito poderá não ter relevância fisiológica. Todavia, após 7 dias de hipertensão ocular, a administração de cafeína aumentou a sobrevivência das células ganglionares da retina, preveniu a resposta neuroinflamatória e reatividade das células da microglia induzidas por hipertensão ocular. Porém, a cafeína não foi eficaz na prevenção de danos funcionais no transporte axonal retrógrado no nervo ótico. Concluindo, os nossos resultados forneceram evidências da capacidade dos antagonistas do A2AR no controlo da reatividade das células da microglia da retina e resposta neuroinflamatória, e também de conferir neuroproteção às células ganglionares da retina, quer em modelos in vitro quer em modelos animais. Tendo em conta a contribuição da neuroinflamação mediada pelas células da microglia na patogénese do glaucoma, os nossos resultados abrem a possibilidade para o uso de antagonistas do A2AR como opções terapêuticas para controlar a perda de células ganglionares da retina no glaucoma.
Glaucoma is the second leading cause of blindness worldwide, being characterized by loss of retinal ganglion cells (RGCs) and optic nerve damage. Early and exarcerbated activation of microglial cells, the immunocompentent cells in the central nervous system (CNS) and strong neuroinflammatory response have been described in glaucoma, which are thought to be involved the processes that lead to RGC death. Advanced age and elevated intraocular pressure (IOP) are considered major risk factors for the development of glaucoma. Currently, the therapeutic approach in glaucoma is lowering the IOP, but many patients continue to lose vision despite the successful control of IOP. Therefore, the development of novel neuroprotective strategies, aimed at preventing RGC loss, might offer potential for the treatment of glaucoma. Adenosine is a crucial neuromodulator in the CNS, which is up-regulated under harmful conditions. It acts on the purinergic P1 inhibitory receptors, A1 and A3, and in the P1 facilitatory A2A and A2B receptors. Adenosine A2A receptor (A2AR) antagonists have emerged as potential neuroprotective agents in brain neurodegenerative diseases, namely by controlling the microglia-mediated neuroinflammatory response. Taking in account the contribution of microglia-mediated neuroinflammation in the pathophysiology of glaucoma, in this work we aimed to evaluate the contribution A2AR blockade in the control of retinal neuroinflammation and its potential neuroprotective effects on RGCs, using in vitro and animal models of glaucoma. In the first part of this work, retinal organotypic cultures were exposed to lipopolysaccharide (LPS; 3 μg/mL), used as an inflammatory stimulus, or elevated hydrostatic pressure (EHP; 70 mmHg above normal atmospheric pressure), to mimic ocular hypertension (OHT), in the presence or absence of the A2AR selective antagonist SCH 58261 (50 nM). An up-regulation of A2AR was detected after exposure to LPS or EHP, and it was paralleled by activation of microglial cells and increased expression of pro-inflammatory markers and reduction in the number of RGCs. The blockade of A2AR prevented the microglia activation and neuroinflammatory response triggered by both conditions. Furthermore, SCH 58261 prevented the loss of RGCs triggered by exposure to LPS and EHP, an effect that was also observed in the presence of antibodies against tumor necrosis factor (TNF) and interleukin-1β (IL-1β). These results suggested that blockade of A2AR prevented the loss of RGCs through the control of the neuroinflammatory response. In order to further elucidate the direct effects of A2AR blockade on the control of retinal microglial cells reactivity, in the second part of this work, primary retinal microglial cell cultures were challenged with LPS or EHP, after a pre-treatment with SCH 58261 (50 nM). Similar to what we observed in retinal organotypic cultures, the blockade of A2AR prevented the effects of LPS and EHP on microglia activation and on the expression of the inflammatory mediators TNF, IL-1β and nitric oxide (NO). The A2AR antagonist also prevented the phagocytic activity of microglia elicited by LPS. Notably, in an animal model of high IOP-induced transient ischemia (I-R), the intravitreal administration of SCH 58261 (100 nM; 5 μL) reduced the I-R-induced neuroinflammatory response in the retina and the loss of RGCs. The injection of antibodies against TNF and IL-1β recapitulated the effects of A2AR antagonist, further supporting the hypothesis that A2AR blockade confers protection to RGCs by reducing the microglia-mediated neuroinflammatory response. Caffeine is an antagonist of adenosine receptors, and it has been shown to confer neuroprotection to the brain through the antagonism of A2AR. Therefore, in the third part of this work, we investigated the effects of caffeine administration (1 g/L, in water) in an animal model of OHT, induced by laser photocoagulation (LP) of the perilimbar and episcleral veins. Caffeine decreased IOP of OHT animals, although this decrease may not be physiologically relevant. Nevertheless, after 7 days of OHT, caffeine administration prevented the OHT-induced microglia activation and neuroinflammatory response and increased the survival of RGCs. Still, caffeine was not able to rescue the functional damage in the retrograde axonal transport in the optic nerve. In conclusion, our results provide evidence for the ability of A2AR antagonists and caffeine to control retinal microglia reactivity and neuroinflammatory response, as well as to confer neuroprotection to RGCs, in both in vitro and animal models of glaucoma. Taking in account the contribution of microglia-mediated neuroinflammation to the pathogenesis of glaucoma, our results open the possibility for the use of A2AR antagonists as therapeutic options to manage neuroinflammation and RGC loss in glaucoma.
Description: Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, na especialidade de Ciências Biomédicas apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/30470
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