Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/30394
Title: Preparação de triterpenóides e avaliação da atividade antiparasitária em tripanossomatídeo Leishmania infantum
Authors: Brás, Micaela Filipa da Cruz
Orientador: Sousa, Maria do Céu Rodrigues de
Salvador, Jorge António Ribeiro
Keywords: Leishmanias; Leishmaniose
Issue Date: 2015
Abstract: A leishmaniose é uma doença infeciosa parasitária endémica em 98 países, predominantemente em regiões tropicais e subtropicais, onde afeta cerca de 12 milhões e coloca em risco mais de 350 milhões de pessoas. O agente etiológico é o tripanossomatídeo do género Leishmania e sua a transmissão ocorre através da picada do flebótomo. Durante o ciclo de vida os parasitas são digenéticos e expostos a diferentes ambientes: um extracelular dentro do hospedeiro invertebrado e um intracelular dentro do hospedeiro vertebrado. Consequentemente, como estratégia de sobrevivência, a Leishmania adota dois estádios morfologicamente distintos: o promastigota e o amastigota. A virulência da Leishmania spp. que causa a infeção e a resposta originada pelo sistema imunitário do hospedeiro são fatores determinantes na manifestação clínica da parasitose: leishmaniose cutânea, leishmaniose mucocutânea e leishmaniose visceral. Segundo a OMS a leishmaniose visceral tem vindo a surgir como uma complicação associada a doenças que comprometem o sistema imunitário, como o VIH, alterando os padrões tradicionais epidemiológicos da transmissão de Leishmania. Os fármacos utilizados possuem limitações nomeadamente o preço, níveis de toxicidade, sucesso reduzido e devido à monoterapia estão associados ao desenvolvimento de resistência. É, portanto, necessário desenvolver terapias alternativas e caracterizar novos alvos terapêuticos para obter tratamentos mais eficientes, específicos e menos tóxicos. Na literatura são encontrados alguns estudos que relatam a atividade anti-Leishmania de triterpenos derivados da betulina e do ácido betulínico. Idealmente, a modificação química destes produtos naturais pode melhorar significativamente a sua atividade e manter os níveis de toxicidade geralmente baixos, sendo por isso uma área de interesse crescente na descoberta de novos compostos com atividade anti-Leishmania. Com o objetivo de estudar a atividade leishmanicida dos derivados da betulina e do ácido betulínico, foram realizados ensaios de viabilidade celular em Leishmania infantum. Entre os 20 compostos testados, três compostos apresentaram elevada atividade anti-Leishmania (CI50<100 μM), seis atividade moderada (100 <CI50> 200 μM) e onze não apresentaram atividade biológica significativa (CI50> 200 μM), A análise da estrutura/atividade dos derivado da betulina indicou que geralmente a carbamoilação das posições C3 e/ou C28 com a inserção do grupo 1,2,4-triazole nessas posições resulta num aumento da atividade leishmanicida, enquanto as mesmas modificações ii realizadas com a adição do grupo 2-metilimidazole conduz à diminuição da atividade, demonstrando-se, assim, a importância do grupo triazole na atividade destes compostos. Os resultados obtidos sugerem que as modificações em C20 e C29 têm um impacto positivo na atividade anti-leishmanicida dos derivados da betulina e que a acetilação das posições C3 e/ou C28 diminui a atividade biológica dos derivados. Nos derivados do ácido betulínico a esterificação dos grupos hidroxilos em C3 e C28 na maioria dos casos reteve a atividade leishmanicida e a oxidação do grupo hidroxilo secundário em C3 aumentou a ação antiparasitária. Os compostos mais ativos, ou seja, que induziram a redução do número de promastigotas sob menor concentração, foram o derivado da betulina 24 (CI50 de 48,68 μM) e o derivado do ácido betulínico 31 (CI50 de 37,54 μM). Foi também objetivo estudar os mecanismos de ação farmacológica dos compostos mais ativos de forma a elucidar possíveis alvos moleculares de atividade anti-Leishmania. Deste modo, estudaram-se os efeitos dos derivados 24 e 31 no ciclo celular e na morfologia do parasita. Os resultados obtidos por citometria de fluxo indicam que os derivados betulínicos testados não alteram de forma significativa o ciclo celular. Deste modo, tudo indica que o mecanismo de ação principal dos derivados betulínicos testados não deverá estar relacionado com a inibição das topoisomerases, enzimas descritas como potenciais alvos celulares. As alterações morfológicas induzidas pelo composto 31, nomeadamente células arredondadas, mais pequenas e com flagelos mais curtos, sugerem que o mecanismo de ação possa estar relacionado com alterações no citoesqueleto, na permeabilidade membranar e/ou na atividade mitocondrial. Em conclusão, os resultados demonstraram a atividade leishmanicida dos derivados betulínicos e permitiram identificar os grupos funcionais mais importantes para a obtenção dessa atividade biológica. As modificações no grupo hidroxilo secundário da posição C3, na porção de alceno da posição C20 e no grupo hidroxilo primário da posição C28 conduziram à obtenção de diversos derivados betulínicos com atividades anti-Leishmania distintas. É de destacar que a adição de grupos triazóis aumenta o potencial dos derivados da betulina contra a Leishmania
Leishmaniasis is a parasitic infectious disease endemic in 98 countries, predominantly in tropical and sub-tropical regions, where it affects about 12 million people, threatening more than 350 million. The causative agent is the trypanosomatid genus Leishmania, and its transmission occurs through the bite of the sand fly. During the life cycle, the parasites are digenetic and exposed to different environments: an extracellular within the invertebrate host, and an intracellular within the vertebrate host. Thus, as a survival strategy, the Leishmania adopts two morphologically distinct stages: the promastigote and amastigote. The virulence of Leishmania spp. that causes the infection and response of the host's immune system are crucial in the clinical manifestation of disease: cutaneous leishmaniasis, mucocutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis. According to WHO visceral leishmaniasis has emerged as a complication associated with diseases that compromise the immune system such as HIV, changing the epidemiological traditional standards of Leishmania transmission. Existing drugs have limitations that are inclusive of price, toxicity levels and reduced success. As a result of monotherapy they are associated with resistance development, hence the necessity to develop alternative therapies and characterize new therapeutic targets for more efficient, specific and less toxic treatments. Literature has found few studies reporting the anti-Leishmania activity of triterpenoids derived from betulin and betulinic acid. Ideally, the chemical modification of these natural products can improve significantly its activity and maintain the generally low levels of toxicity. Therefore, this is an area of increasing interest for the discovery of novel compounds with anti-Leishmania activity. With the aim of studying the leishmanicidal activity of derivatives of betulinic acid and betulin, the cell viability assays were performed in Leishmania infantum. Among the 20 compounds tested, three compounds were highly anti-Leishmania activity (IC50 <100 μM), six moderate activity (100 <IC50> 200 μM) and eleven showed no significant biological activity (IC50> 200 μM). The analysis of the structure/activity of betulin derivative indicated that generally carbamoylation on C3 and C28 positions coupled with the introduction of 1,2,4-triazole group at these positions, resulting in an improvement of leishmanicidal activity, while the same modifications made to the addition of 2-methylimidazole group leads to decreased activity. These results demonstrate the importance of the triazole group in the activity of these compounds. The results also suggest that modifications in C20 and C29 have a positive impact on the leishmanicidal activity of anti-derivatives of betulin and that acetylation of positions C3 iv and / or C28 decreases the biological activity of the derivatives. In betulinic acid derivatives esterification of the hydroxyl groups in C3 and C28, in most cases retained anti-leishmanial activity and the oxidation of the secondary hydroxyl group at C3 increased the anti-parasitic action. The most active compounds that induced reduction of promastigotes in low concentration, were the betulin derivative 24 (IC50 = 48.68 μM) and the derivative of betulinic acid 31 (IC50 = 37.54 μM). The study of the pharmacological action mechanisms of the active compounds was also intended in order to elucidate possible molecular targets of anti-Leishmania activity. In this way, it is studied the effects of 24 and 31 derivatives in cell cycle and in the morphology of parasites. The results obtained by flow cytometry suggest that the tested derivatives betulínicos not significantly alter the cell cycle. Thus, it appears that the main mechanism of action of the tested betulínicos derivatives should not be related to the inhibition of topoisomerases, enzymes described as potential cellular targets. The morphological changes induced by compound 31, in particular round cell smaller and shorter flagella, suggest that the mechanism of action could be related cytoskeleton alterations in membrane permeability and/or mitochondrial activity. In conclusion, the results demonstrated the activity of leishmanicidal betulínicos derivatives and helped to identify the most important functional groups to obtain this biological activity. Changes in secondary hydroxyl group of the C3 position, the alkene portion of the C20 position and the primary hydroxyl group in C28 position prompt to obtain various betulinic derivatives with distinct anti-Leishmania activity. It is noted that the addition of triazole groups increase the potential of betulinic derivatives against Leishmania
Description: Dissertação de mestrado (Quimica Farmacêutica Industrial), apresentada á Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/30394
Rights: openAccess
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UC - Dissertações de Mestrado

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