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Title: Fragaria vesca leaf as a source of bioactive phytochemicals - a focus on ellagitannins and their human microflora metabolites
Authors: Liberal, Joana Manuela Torres 
Orientador: Batista, Maria Teresa
Rosete, Maria Teresa
Keywords: Polifenóis; Elagitaninos; Proliferação celular; Urolitinas; Fragaria vesca
Issue Date: 14-Jun-2016
Citation: LIBERAL, Joana Manuela Torres - Fragaria vesca leaf as a source of bioactive phytochemicals : a focus on ellagitannins and their human microflora metabolites. Coimbra : [s.n.], 2016. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/30182
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/72918/2010/PT/DISCOVERY OF NEW ANTI-INFLAMMATORY DRUGS FROM NATURAL PRODUCTS THROUGH BIO-GUIDED ASSAYS 
Abstract: Ao longo do tempo, os produtos naturais têm sido uma importante fonte de novas moléculas com atividade farmacológica. Em particular, das plantas têm sido isolados metabolitos secundários com propriedades biológicas, nomeadamente anti-inflamatória, anti-oxidante e anticancerígena. Estudos etnofarmacológicos referem que a folha da Fragaria vesca L., planta popularmente conhecida como morangueiro silvestre, tem sido utilizada no tratamento de diversas patologias. Contudo, existe muito pouca informação científica relativa aos mecanismos de ação molecular subjacentes ao seu efeito terapêutico. Com o objetivo de validar os seus usos tradicionais e avaliar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos nas atividades biológicas da Fragaria vesca, preparou-se um extrato hidroalcoólico a partir das suas folhas, e este foi quimicamente caracterizado relativamente ao seu perfil polifenólico por HPLC/PDA/ESI-MSn. A análise fitoquímica permitiu identificar 20 polifenóis, entre os quais elagitaninos, proantocianidinas e conjugados glucoronados de conferol e quercetina. As propriedades anti-inflamatórias do extrato foram avaliadas numa linha celular de macrófagos de ratinho (Raw 264.7), observando-se uma inibição da produção de monóxido de azoto estimulada por lipopolissacarídeo, sendo que este efeito se deveu maioritariamente à atividade scavenger do próprio extrato. Adicionalmente demonstrou-se que o extrato modula as vias proteolíticas da célula através da redução da atividade do proteassoma e modulação da autofagia, alvos celulares extremamente atrativos em estratégias terapêuticas anti-tumorais. Assim, com o propósito de aquilatar os compostos responsáveis por estes efeitos biológicos procedeu-se ao fracionamento do extrato, sendo selecionada uma fração composta maioritariamente por elagitaninos. A fração foi analisada por HPLC/PDA/ESI-MSn o que permitiu detectar 12 elagitaninos. A viabilidade da linha celular do carcinoma hepatocelular humano (HepG2) foi avaliada após tratamento com a fração e com o extrato hidroalcoólico, e as concentrações necessárias para inibir 50% da viabilidade celular (IC50) foram determinadas. O IC50 da fração enriquecida em elagitaninos (113 µg/mL) foi aproximadamente 6 vezes inferior ao IC50 do extrato hidroalcoólico (690 µg/mL). O efeito da fração na proliferação celular e no ciclo celular foi igualmente alvo de estudo, observando-se que o tratamento diminuiu a proliferação celular através de uma resposta dependente da concentração e induziu uma acumulação de células em G2/M. Paralelamente, demonstrou-se que a fração induziu um bloqueio do fluxo autofágico responsável pela acumulação da proteína LC3-II, promoveu a acumulação de proteínas conjugadas com a ubiquitina, inibiu a atividade do tipo quimiotripsina da subunidade 26S do proteossoma e diminuiu a expressão de algumas subunidades do proteassoma, enfatizando uma inibição da degradação proteolítica mediada pela via ubiquitina-proteossoma. Adicionalmente, a análise do proteoma das células com recurso ao método proteómico quantitativo (iTRAQ) permitiu identificar 914 proteínas, das quais 133 mostraram ser moduladas pela fração, com especial destaque para proteínas envolvidas em processos de metabolismo celular. Recentemente, os alimentos que contêm elagitaninos têm suscitado considerável atenção na comunidade científica devido aos seus efeitos benéficos na saúde humana, sendo particularmente associados a potenciais efeitos quimioterapêuticos. Dada a baixa biodisponibilidade dos elagitaninos e sabendo-se que são metabolizados no trato intestinal em ácido elágico e posteriormente em urolitinas, hipotetiza-se que as suas propriedades benéficas sejam devidas ao efeito direto dos seus metabolitos. Tendo em conta as considerações acima explanadas, a atividade antiproliferativa dos principais metabolitos dos elagitaninos foram também alvo de estudo. Demonstrou-se que as urolitinas A, B e C diminuíram a viabilidade celular de cinco linhas tumorais humanas, apresentando um efeito dependente da concentração, e o precursor comum destas moléculas, o ácido elágico, revelou ser menos ativo que as urolitinas. Os resultados enfatizaram ainda diferenças claras entre os efeitos biológicos das urolitinas estudadas e, no geral, a urolitina A foi a molécula mais promissora. Na linha celular de cancro da bexiga (UMUC3), a urolitina A induziu a paragem do ciclo celular, aumentou a apoptose e modulou as vias de sinalização celular PI3K/Akt e MAPKs. Na linha celular humana de osteossarcoma (MNNG-HOS), a urolitina A teve um efeito semelhante, embora menos pronunciado, indicando que o efeito desta molécula não é dependente do tipo de célula. Os resultados permitiram ainda concluir que a urolitina B foi a molécula menos ativa em ambas as linhas celulares. Deste modo, considerando as diferenças estruturais das três urolitinas testadas, os resultados realçam a importância do número/posição dos grupos hidroxilo na atividade destas moléculas, fato extremamente relevante no desenho de moléculas bioativas baseadas nas urolitinas. Em suma, estes resultados sugerem que a folha da Fragaria vesca poderá ser uma relevante fonte de moléculas com potencial terapêutico, principalmente tendo em conta os resultados notáveis na autofagia e no proteassoma. Suportando estes resultados, a fração enriquecida em elagitaninos demonstrou também inibir estes mecanismos proteolíticos bem como modular vários processos celulares e moleculares associados à carcinogénese. Por outro lado, este trabalho sustenta a importância do estudo dos metabolitos dos polifenóis, e em particular dos elagitaninos, encorajando fortemente estudos científicos focados no desenvolvimento de fármacos com ação quimiopreventiva/quimioterapêutica tendo por base estes metabolitos.
Natural products have been a rich source of novel lead molecules with pharmacological activity for drug discovery. Notably, plants have had a relevant role, being widely shown that many plant-derived compounds have anti-inflammatory, antioxidant and anticancer activities. The leaf of Fragaria vesca L., a plant commonly known as wild strawberry, has been used over the years by traditional medicine for the treatment of several diseases. However, scientific reports disclosing its molecular mechanisms of action are still lacking. Therefore, to validate its traditional uses and to unveil the mechanisms involved in the activities previously reported, a hydroalcoholic extract from Fragaria vesca leaves was obtained. The phytochemical characterization was performed by HPLC-PDA-ESI/MSn. Twenty compounds were tentatively identified, and among them ellagitannins, proanthocyanidins, and quercetin and kaempferol glucuronide derivatives were the main ones. Thereafter, using a mouse macrophage cell line (Raw 264.7), we observed that the extract inhibited the production of nitric oxide (NO) triggered by lipopolysaccharide, which was probably due to a direct scavenge of NO. The extract also affected the cellular proteolytic pathways, through the reduction of the proteasome activity and modulation of the autophagic machinery, mechanisms that are currently considered very attractive therapeutic targets in cancer treatment. In order to identify the compounds responsible for these effects, the extract was further fractionated and an ellagitannin-enriched fraction (EEF) was selected. The analysis of EEF by HPLC-PDA-ESI/MSn allowed the detection of 12 ellagitannins. The cell viability of both EEF and crude extract was determined after 24 h of cells treatment and the half-maximal inhibitory concentration (IC50) was calculated. The IC50 of the EEF (113 µg/mL) was about 6 times lower than the IC50 of the crude extract (690 µg/mL). Furthermore, EEF induced cell cycle arrest at G2/M checkpoint and decreased cell proliferation in a dose-dependent way. This fraction also induced an accumulation of LC3-II protein through blockage of autophagic flux, and promoted the accumulation of ubiquitinated proteins, inhibited chymotrypsin-like activity of 26S proteasome and decreased the expression of several proteasome subunits, indicating an impairment of ubiquitin-proteasome system. Furthermore, to further unveil other putative molecular targets of EEF, an iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation) based proteomics approach was performed. Several proteins (914) were identified, among which 133 proteins were significantly modulated, most of them related to metabolic processes. Recently, ellagitannins-containing foods have gathered much attention due to their health benefits, namely their chemopreventive potential. Given the low bioavailability of those molecules and their metabolization in the gastrointestinal tract into ellagic acid and consequently into urolithins, the systemic health benefits of their consumption may be a consequence of a direct effect of ellagitannins metabolites. Therefore, the antiproliferative effects of the main metabolites produced after ingestion of ellagitannins-containing foods, ellagic acid and urolithins A, B and C were investigated. The results indicate that urolithins A, B and C, decreased cell viability in a dose-dependent way in several human cancer cell lines and, in comparison with ellagic acid, their precursor, urolithins were much more active. Furthermore, clear differences among the compounds tested were shown, and, overall, urolithin A was the most promising molecule. In UMUC3 bladder cancer cells, urolithin A induced cell cycle arrest, increased apoptosis and modulated the intracellular PI3K/Akt and MAPKs signaling pathways. In human osteosarcoma cells (MNNG-HOS), although not so pronounced, the effects of urolithin A on cell death and cell cycle were similar, indicating that those effects are not cell type-specific. Furthermore, urolithin B was, in both cell lines, the less active molecule. Considering the structural differences between these three urolithins, the results highlight the significance of the number/position of hydroxyl groups for urolithins’ activity, which constitutes valuable information in the design of urolithin-based molecules presenting potent bioactivity. In conclusion, Fragaria vesca leaf is a source of molecules with therapeutic potential and with a notable effect on autophagy and proteasome. Furthermore, EEF markedly inhibited these proteolytic systems and modulated several cellular and molecular processes implicated in carcinogenesis. Moreover, this work generated important insights in the therapeutic value of ellagitannins metabolites, the urolithins, strongly supporting and encouraging further work on ellagitannins and urolithins in order to unveil their potential as chemopreventive/chemotherapeutic drugs.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Biologia Celular Molecular, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/30182
Rights: openAccess
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