Title: Regulation of Local Translation by BDNF: Effects on NMDA Receptor Trafficking
Authors: Afonso, Pedro João Madeira 
Orientador: Armanda, Santos
Duarte, Carlos
Keywords: Plasticidade Sináptica;BDNF;Long-term potentiation (LTP);Hippocampus
Issue Date: 20-May-2016
Citation: AFONSO, Pedro João Madeira - Regulation of local translation by BDNF : effects on NMDA receptor trafficking. Coimbra : [s.n.], 2016. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/30181
Abstract: As sinapses excitatórias são estruturas dinâmicas e a forma como neurónios vizinhos comunicam entre si é ajustada consoante a actividade neuronal. A esta propriedade chama-se plasticidade sináptica e a nível molecular está correlacionada com a aprendizagem e a memória. A potenciação sináptica de longa duração (LTP) é a forma de plasticidade sináptica mais estudada sendo definida como um fortalecimento duradouro na comunicação entre neurónios vizinhos desencadeado pela actividade neuronal. Pelo contrário, a depressão sináptica de longa duração (LTD) é caracterizada por uma diminuição duradoura da potência sináptica. Alterações moleculares nos mecanismos de plasticidade sináptica estão na base de muitas doenças neurológicas e psiquiátricas. Algumas das modificações sinápticas ao nível estrutural, bioquímico e funcional associadas com a plasticidade sináptica requerem a traducão de mRNAs (RNA mensageiros) localizados nas dendrites, resultando em alterações no proteoma sináptico. Várias evidências mostram que a síntese proteica em dendrites desempenha um papel fundamental em várias formas de plasticidade sináptica, incluindo a LTP mediada pelo BDNF (factor neurotrófico derivado do cérebro). Contudo, pouco se sabe sobre a identidade dos mRNA que são traduzidos ao nível da sinapse em resposta ao BDNF e sobre os mecanismos de regulação envolvidos. Além disso, também está ainda por esclarecer de que modo muitas das alterações no proteoma sináptico contribuem para os fenómenos de plasticidade sináptica. Neste trabalho investigámos o papel da Pyk2 (cinase de resíduos de tirosina rica em prolina do tipo 2) na mediação dos efeitos do BDNF na sinapse. A Pyk2 é uma cinase de resíduos de tirosina pertencente à família das FAK (cinases de adesão focal), que desempenha uma grande variedade de funções no sistema nervoso central, incluindo o control da LTP e da LTD por mecanismos que envolvem a regulação dos receptores NMDA (N-metil-D-aspartato). Além disso, pensa-se que esta cinase desempenha um papel importante na remodelação da arquitectura das espículas sinápticas e da arborização dendritica, induzidas pela actividade neuronal. Observámos que a Pyk2 é traduzida ao nível da sinapse e acumulada nas densidades pós-sinápticas de neurónios do hipocampo após a estimulação com BDNF. A acumulação dendritica da Pyk2 em resposta à estimulação com BDNF requer a participação da RBP (proteína que liga RNA), hnRNPK (ribonucleoproteína nuclear heterogénea do tipo K). Estas observações estão de acordo com os resultados anteriores do nosso laboratório mostrando que: (i) a hnRNPK é acumulada nas dendrites dos neurónios do hipocampo após o estimulação com BDNF; (ii) a ligação do mRNA da Pyk2 à hnRNPK é regulada por BDNF. Usando um protocolo químico para aumentar a actividade neuronal e induzir LTP também observámos que a Pyk2 se acumula na sinapse por um mecanismo dependente de BDNF. A principal função da Pyk2 ao nível da densidade pós-sináptica tem sido associada à regulação das correntes mediadas pelos recetores NMDA através da interação direta com a Src, outra cinase de resíduos de tirosina. Neste estudo, observámos que o tratamento com BDNF aumenta a expressão superficial dos receptores NMDA que contêm a subunidade GluN2B, ao nível da sinapse, por um mecanismo dependente da síntese proteica. De acordo com estas observações, observou-se que a estimulação com BDNF aumenta os níveis de Pyk2 fosforilada/activada de forma específica ao nível da sinapse, o que sugere uma regulação diferencial da atividade da cinase. O aumento dos níveis sinápticos dos recetores NMDA induzido pelo BDNF também depende da Pyk2 e da sua actividade de cinase. Por outro lado, também se observou que em condições de repouso a manutenção na membrana celular dos recetores NMDA contendo subunidades GluN2B depende da atividade de cinase da Pyk2. Finalmente, a sobreexpressão da Pyk2 em neurónios do hipocampo foi suficente para mimetizar os efeitos do BDNF na expressão superficial dos receptores NMDA que contêm a subunidade GluN2B. No seu conjunto, os resultados mostram que o BDNF induz a activação/acumulação da Pyk2 por um mecanismo que envolve a hnRNPK e a síntese dendritica da Pyk2, resultando num aumento da expressão superfical dos receptores NMDA que contêm a subunidade GluN2B. Este mecanismo pode mediar os efeitos do BDNF nos défices cognitivos que são característicos de certas doenças do cérebro.
Excitatory synapses are dynamic entities and adjust their strength depending on the activity. This property is named synaptic plasticity and is considered the cellular correlate of learning and memory. Long-term potentiation (LTP) is the best studied form of synaptic plasticity and by definition it is considered as an activity-induced sustained increase in synaptic strength. Long-term depression (LTD) is the opposite form of plasticity, and is characterized by an activity-induced sustained decrease in synaptic strength. Alterations in the molecular basis of synaptic plasticity events underlie several neurological and psychiatric disorders. Some of the structural, biochemical and functional modifications of the synapse associated with synaptic plasticity require translation of dendritic-localized mRNAs, with concomitant alterations in the synaptic proteome. Multiple lines of evidence show that dendritic protein synthesis plays a key role in several forms of synaptic plasticity, including in brain-derived neurotrophic factor (BDNF)-mediated LTP. However, the identity of the mRNAs that are synaptically translated in response to BDNF and the regulatory mechanisms involved are poorly understood. Furthermore, how these changes in the proteome contribute to the plastic alterations of the synapse also remains to be uncovered. In this work, we investigated a role for Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase 2) as a mediator of the effects of BDNF at the synapse. Pyk2 is a non-receptor tyrosine kinase, belonging to the FAK (focal adhesion kinase) family of proteins, which plays a wide range of functions in the central nervous system (CNS), including the control of LTP and LTD by mechanisms involving the regulation of NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptors. Furthermore, this kinase is thought to play an important role in the activity-induced remodeling of spine architecture and dendritic arborization. We found that the protein kinase Pyk2 is synaptically translated in hippocampal neurons and accumulates at post-synaptic density following BDNF treatment. The dendritic accumulation of Pyk2 upon stimulation with BDNF requires the participation of the RNA-binding protein hnRNPK (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K). This is in accordance with previous results from our laboratory showing that (i) hnRNPK is accumulated in dendrites of hippocampal neurons upon BDNF treatment and (ii) the binding of Pyk2 mRNA to hnRNPK is regulated by BDNF. Using a chemical protocol to increase neuronal activity and to induce LTP, we also observed that Pyk2 accumulates at the synapse by a mechanism requiring BDNF. The main function of Pyk2 at the post-synaptic compartment has been attributed to the regulation of NMDA receptor currents through a direct interaction with a different tyrosine kinase, Src. Herein we found that BDNF treatment increases the surface expression of GluN2B-containing NMDA receptors (NMDAR) at synapses, by a mechanism dependent on protein synthesis. In agreement with these observations, the levels of phosphorylated/activated Pyk2 were specifically enhanced at the synapse upon BDNF treatment, suggesting a compartment-specific regulation of Pyk2 activity by BDNF. The BDNF-induced increase on surface NMDARs also requires Pyk2 and its kinase activity. The maintenance of basal levels of GluN2B-containing NMDAR at the cell surface was also dependent on Pyk2 kinase activity. Finally, overexpression of Pyk2 in hippocampal neurons was sufficient, per se, to mimic the BDNF-induced increase in GluN2B-NMDAR surface expression. Taken together, the results show that BDNF induces synaptic activation/accumulation of Pyk2 by a mechanism involving hnRNPK and dendritic Pyk2 synthesis, resulting in an enhancement in the surface levels of GluN2B-containing NMDAR. This mechanism may mediate the effects of BDNF on synaptic plasticity and may constitute a novel therapeutic target to restore the cognitive deficits characteristic of some brain disorders.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Biologia Celular e Molecular, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/30181
Rights: embargoedAccess
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