Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/30075
Title: Pollen proteases and allergic disorders
Authors: Gaspar, Ricardo Lourenço 
Orientador: Verissímo, Paula
Keywords: Polén; Alergias
Issue Date: 2012
Citation: Gaspar, Ricardo Lourenço. Pollen proteases and allergic disorders. Coimbra, 2012. Teses de Mestrado
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Allergic disorders, namely asthma, are increasingly prevalent in the development world, and for that reason taken as a serious public health issue. Allergic disorders are recognized as inflammatory disorders of the respiratory airways, and are considered to be triggered in part by pollen. Pollen allergies, where respiratory allergic reactions are induced by pollens, have been showed to be increasing in Europe (Burney et al., 1997; D´Amato et al., 2000). Pollen grains when inhaled and contact the respiratory mucosa are hydrated, releasing allergenic material and proteases. Proteases have been shown to cause epithelium barrier breakdown allowing allergens to contact cells of the immune system, initiating allergic response and perpetuate inflammation (Cortes et al., 2006; Runswick et al., 2007; Takai et al., 2011; Vinhas et al., 2011). This study focused on three pollen species with different allergenic potential that are widespread over the Mediterranean area: Chenopodium sp. (moderate allergenic), Eucalyptus sp. (low allergenic) and Plantago sp. (moderate allergenic). Identification of proteolytic activity present in the pollen extracts occurred using zymographys and enzymatic assays, which allowed the perception of high molecular weight proteases with acidic pI. Also, it was observed a majority presence of serine and metalloproteinases in all pollen extracts, with some interesting cysteine activity in Chenopodium sp. and Eucalyptus sp. pollen extracts. In order to comprehend the mechanism subjacent to lung epithelium breakdown caused by the exposure to pollen, we resorted to a Human epithelial cell line, Calu-3. The proteolytic activity present in all three pollen extracts were capable of inducing an increase of epithelial permeability in a time-dependent manner and in vitro cell detachment by disruption of intercellular protein complexes formed between epithelial cells, namely E-cadherin, Occludin, ZO-1 and Claudin-1. This is obviously due to a direct digestive action of proteases on the respiratory airway epithelium. The effect of Chenopodium sp. was tremendous compared to the other two pollen extracts possibly correlated also to the significant presence of both serine and cysteine activity. The loss of epithelial effectiveness can also occur indirectly through activation of PAR-2 receptors widely expressed on the apical surface of lung epithelial cells. Serine proteases have the ability in activating proteolytically PAR-2 receptors, which 14 coupled to G-signaling cascades increase phospholipase C levels which in turn lead to increased intracellular Ca2+ levels (Berger et al., 2001; Schechter et al., 1998; Ubl JJ et al., 2002). This induces a suggested release of chemokines, cytokines and neurotransmitters through signaling cascades. The proinflammatory role of PAR-2 has been supported by many studies (Sun et al., 2001; Asokananthan et al., 2002; Adam et al., 2006). Increased intracellular Ca2+ levels were induced when exposed to the pollen extracts from Chenopodium sp. and Eucalyptus sp. After exposure to pollen extract from Plantago sp. no visual increase of intracellular calcium was observed, possibly due to a low protease concentration present in the extract. The effect observed was again tremendous for Chenopodium sp., concurrent to what was obtain for induced increased transepithelial permeability and disruption of protein junctions. All pollen extracts were also able to induce the production and release of pro-inflammatory cytokines, namely IL-6 and IL-8. In the natural environment the respiratory system is exposed to multitude of pollens with overlapping pollination seasons: time and geographic dependent, as verifiable through epidemiologic studies. For that reason, we studied combinations of pollen extracts. The purpose was to observe possible alterations of proteolytic activity when combined. Two combinations of pollen extracts were studied: Chenopodium sp. with Eucalyptus sp. and Chenopodium sp. with Plantago sp. Basically, we observed that the presence of Chenopodium sp. was able to potentiate and increase the effect of the other pollen extracts when combined via directly and indirectly in lung epithelium disruption. These studies conducted in this research work are of great importance in obtaining a deeper knowledge of the mechanisms involved in the development of allergic disorders to pollens. Only by these studies will it be possible to correlate proteolytic activity with loss of respiratory airway epithelium integrity and the potentiating of allergic responses. Important also, is the fact that our work suggests that even less allergenic pollens are likely to participate in allergic sensitization and airway inflammation, possibly through access facilitation to a variety of allergens and exposing them to cells of the immune system. These results can be of great interest in the attempt of developing future therapies for allergic disorders.
As doenças alérgicas, nomeadamente a asma, têm vindo a aumentar no mundo desenvolvido. As doenças alérgicas são reconhecidas como patologias inflamatórias das vias respiratórias, despoletadas por pólen. Alergias polínicas, induzidas pela exposição a pólen, têm vindo a crescer na Europa (Burney et al., 1997; D´Amato et al., 2000). Grãos de pólen, após inalados, chegam à mucosa das vias aéreas onde são hidratados, libertando o seu conteúdo: material alergénico e proteases. Tem sido demonstrado a capacidade das proteases causarem fragilização do epitélio respiratório permitido alérgenos contactar com as células do sistema imunitário, iniciando a responsa alérgica e perpetuando a inflamação (Cortes et al., 2006; Runswick et al., 2007; Takai et al., 2011; Vinhas et al., 2011). Neste trabalho foram estudados três pólenes distintos, bem disseminadas pela zona Mediterrânea, com distintas capacidades alergénicas: Chenopodium sp. (alergenicidade moderada), Eucalyptus sp. (alergenicidade baixa) e Plantago sp. (alergenicidade moderada). A identificação da atividade proteolítica presente nos extratos polínicos foi possível através de zimografias e ensaios enzimáticos específicos, que permitiram demonstrar a presença de proteases com alto peso molecular e pI acídico. Verificou-se uma maioritária atividade serínica e metalloproteinase, como também uma atividade cisteínica adicional nos extratos polínicos do Chenopodium sp. e Eucalyptus sp. De forma a compreender o mecanismo subjacente à perda de integridade do epitélio após exposição ao pólen, recorremos a uma linha de células epiteliais Humanas, Calu-3. A atividade proteolítica presente nos extratos polínicos foi responsável pelo destacamento celular in vitro, verificando-se um aumento da permeabilidade transepitelial, como resultado da disrupção dos complexos proteicos intercelulares formados entre as células epiteliais, nomeadamente a E-caderina, Ocludina, ZO-1 e Claudina-1. Este efeito sugere uma acção directa de degradação das proteases sobre o epitélio respiratório. O efeito do Chenopodium sp. foi muito superior, possivelmente correlacionado com a presença bastante significativa de atividades serínica e cisteínica. A perda de integridade do epitélio também pode ser, indiretamente, resultado de uma ativação dos receptores PAR-2, largamente expressos na superfície apical das 16 células epiteliais. Proteases serínicas possuem a capacidade de ativar proteoliticamente os receptores PAR-2, que acoplados com proteínas G sinalizadoras, aumentam os níveis de fosfolipase C que por sua vez aumentam os níveis intercelulares de Ca2+ (Berger et al., 2001; Schechter et al., 1998; Ubl JJ et al., 2002). É sugerido uma indução de libertação de citoquinas, quimiocinas e neurotransmissores através de cascatas sinalizadoras. Este papel pró-inflamatório dos PAR-2 é referenciado em vários estudos científicos (Sun et al., 2001; Asokananthan et al., 2002; Adam et al., 2006). A exposição dos extratos polínicos do Chenopodium sp. e Eucalyptus sp. induziram um aumento dos níveis intercelulares de Ca2+. Em relação ao extrato polínico do Plantago sp. não se verificaram alterações visíveis nos níveis intercelulares de cálcio, provavelmente devido a uma baixa concentração de proteases no extrato. Mais uma vez este efeito foi muito mais significativo para o Chenopodium sp., concordante com o aumento elevado induzido da permeabilidade transepitelial e na degradação das juncões proteicas Todos os extratos polínicos induziram a libertação de citoquinas proinflamatórias, nomeadamente IL-6 e IL-8. No ambiente natural o sistema respiratório é exposto a uma multiplicidade de pólenes distintos que tenham períodos de polinização sobrepostos, dependente a nível geográfico e temporal verificável por estudos epidemiológicos. Por esta razão, foram estudados duas combinações de pólen, Chenopodium sp. com Eucalyptus sp. e Chenopodium sp. com Plantago sp., de forma a observar possíveis alterações a nível da atividade proteolítica quando combinados. Basicamente, observou-se que a presença do Chenopodium sp. era capaz de potenciar o efeito do outro pólen quando combinado, quer diretamente ou indiretamente na perda de integridade do epitélio pulmonar. Estes estudos conduzidos neste trabalho são de grande valor no aprofundar do conhecimento nos mecanismos envolvidos no desenvolvimento das doenças alérgicas induzidas pelo pólen. Só com estes estudos será possível correlacionar a atividade proteolítica com a perda de integridade epitelial e a potenciação da resposta alérgica. Importante, o nosso trabalho sugere que mesmo pólenes menos alergénicos provavelmente participam na sensibilização alérgica e inflamação das vias aéreas, possivelmente facilitando o acesso a uma variedade de alérgenos com uma consequente exposição às células do sistema imunitário. Estes resultados podem ser de grande interesse na tentativa de desenvolvimento de futuras terapias para as doenças alérgicas.
Description: Dissertação de mestrado em Bioquímica apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/30075
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado

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