Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/29898
Title: Alteration of GABA AR trafficking in epilepsy
Authors: Vieira, Ricardo da Costa Barbedo 
Orientador: Mele, Miranda
Girão, Henrique
Keywords: Epilepsia; Receptores do GABA-A
Issue Date: 2015
Abstract: A epilepsia é uma patologia crónica caracterizada por ataques epiléticos espontâneos. Esta patologia afeta cerca de 65 milhões de pessoas no mundo inteiro, de todas as idades e ambos os géneros. Pensa-se que a génese e/ou propagação dos ataques epiléticos tem origem na hiperexcitabilidade neuronal. No sistema nervoso central, o balanço entre a atividade excitatória e inibitória é maioritariamente mediada pelo glutamato, um neurotransmissor excitatório, e pelo ácido gama-aminobutírico (GABA), um neurotransmissor inibitório. O GABA atua, em parte, através da ativação de recetores de GABA do tipo A (GABAAR), os quais são, na sua grande parte, constituídos por duas subunidades α, duas β e uma subunidade γ2. Os GABAARs apresentam uma grande mobilidade na membrana, podendo deslocar-se entre as regiões sinápticas e extra-sinápticas. A acumulação dos GABAARs nas sinapses inibitórias é regulada pela proteína scaffold gefirina, a qual desempenha um papel importante no controlo da neurotransmissão GABAérgica rápida. A expressão superficial dos recetores GABAA é também influenciada pela taxa de internalização, a qual ocorre em regiões extra-sinápticas, assim como por mecanismos de regulação intracelular que determinam a taxa de reciclagem. Ataques epiléticos simples ou recorrentes provocam uma desregulação das sinapses GABAérgicas a diferentes níveis. Porém, os mecanismos moleculares responsáveis por esta desregulação ainda não estão completamente estudados. Resultados obtidos por imunohistoquímica sugerem que o aumento do número de axónios e de terminais GABAérgicos observados na epilepsia do lobo temporal, tanto em humanos como em modelos animais, pode estar relacionado com o sprouting de neurónios GABAérgicos. No entanto, a possibilidade deste efeito ser devido a um aumento da produção de GABA ou de marcadores relacionados não foi descartada. Foi também sugerido que alterações na população de GABAARs pós-sinápticos podem contribuir para a redução da atividade inibitória do GABA em neurónios principais durante o status epilepticus (SE). Efectivamente, no status epilepticus foi demonstrada uma perda rápida de GABAARs sinápticos que contém subunidades β e γ, enquanto que GABAARs extra-sinápticos que contém subunidades α e δ não sofrem alterações. Estas alterações na expressão superficial dos GABAAR estão correlacionadas com o decréscimo nas mIPSCs observadas após a indução de SE. Porém, os mecanismos responsáveis pela alteração na expressão superficial dos GABAARs no SE não estão ainda bem esclarecidos. O objetivo principal deste trabalho foi o estudo das alterações pós-sinápticas induzidas pelo SE ao nível das sinapses GABAérgicas. Para este propósito, implementámos um sistema in vitro simples que consiste em culturas de neurónios de hipocampo que foram expostos transitoriamente a uma solução desprovida de Mg2+ (SE). Observámos que o SE aumenta os níveis de [Ca2+]i através de um mecanismo dependente da ativação de recetores N-metil-D-aspartato (NMDA). Imagiologia de cálcio em células individuais, usando Fluo-4, permitiu observar diferentes padrões de variação de [Ca2+]i em função do período de exposição ao SE. Usando o mesmo modelo, verificámos um aumento da internalização de GABAARs, acompanhada por um decréscimo da fosforilação da subunidade β3 e uma clivagem da gefirina. Estes resultados indicam que a estabilidade sináptica dos GABAARs é comprometida pelo SE, durante e depois da crise. Mostrámos também que o 8 SE provoca uma redução na taxa de reciclagem dos recetores GABAAR. No conjunto, os nossos resultados demonstram que o SE provoca diversas alterações na sinapse GABAérgica, nomeadamente no tráfego dos recetores e na modulação do seu destino pós-endocitose, acompanhado por uma destabilização da homeostasia do cálcio. Esta dissertação oferece as bases para uma nova linha de investigação tendo por objetivo o estudo dos danos provocados pelo SE em neurónios de hipocampo. Uma melhor compreensão destes mecanismos moleculares pode permitir identificar novos alvos terapêuticos para o tratamento do SE e novas estratégias para prevenir o desenvolvimento de epilepsia crónica.
Epilepsy is a chronic condition characterized by recurrent unprovoked seizures. The disease affects approximately 65 million people worldwide, from all ages and both genders. It is thought that neuronal hyper-excitability is one of the main permissive factors for the genesis and/or propagation of epileptic seizures. In the Central Nervous System (CNS) the balance between excitation and inhibition is mostly regulated by the excitatory neurotransmitter glutamate and the inhibitory γ-aminobutyric acid (GABA), respectively. The neurotransmitter GABA acts, in part, through activation of GABAA receptors (GABAAR), which are mostly composed of 2α-, 2β-, and 1γ2-subunits, and the accumulation of these receptors at inhibitory synapses is regulated by the scaffold protein gephyrin. GABAAR present a dynamic mobility between synaptic and extrasynaptic localization, and modulation of the interaction between GABAAR and gephyrin plays an important role in the control of fast GABAergic signalling strength. Total surface expression of GABAAR is controlled by their internalization at extrasynaptic sites, in addition to post-internalization sorting mechanisms which determine the rate of recycling. Single and recurrent seizures lead to a dysregulation of GABAergic synapses at different levels, but the mechanisms involved are still not fully understood. Sprouting of GABAergic neurons may account for the observed persistence or increase in labelling of GABAergic axons and terminals in human temporal lobe epilepsy and related animal models. However, the possible contribution from an increased expression of GABA or related markers in other neurons was not ruled out. Alterations in the population of postsynaptic GABAAR were also suggested to partly contribute to the reduction of GABA-mediated inhibition of principal neurons in status epilepticus (SE). SE was shown to trigger a rapid loss of synaptic GABAAR containing β and γ subunits, while extrasynaptic receptors containing α and δ subunits remain unaffected. These alterations in the surface expression of the receptors directly link the decrease in the miniature inhibitory post-synaptic currents observed after induction of SE with the selective internalization of synaptic GABAAR containing β and γ subunits. However, the mechanisms underlying the effects of SE on the surface expression of GABAAR is not fully elucidated. The main objective of this work was to further investigate the SE-induced post-synaptic alterations in GABAergic synapses. For this purpose we implemented a simple in vitro system consisting in cultured hippocampal neurons, which were exposed transiently to a solution lacking Mg2+ (status epilepticus; SE). We observed that SE increases the [Ca2+]i by a mechanism dependent on the activation of N-methyl-D-aspartate receptors. However, single cell calcium imaging with Fluo-4 showed different patterns of [Ca2+]i, which were also determined by the duration of the SE period. Using the same experimental approach we found an enhanced internalization of GABAARs which was accompanied by a decrease in the phosphorylation of the β3 subunit and a cleavage of gephyrin. Together, these results indicate that GABAAR synaptic stability is compromised during and after SE, and additional experiments showed a reduction in the rate of receptor recycling in hippocampal neurons subjected to SE. Our results demonstrate that SE evokes short- and long-term alterations in GABAergic synapses, namely in receptor trafficking and in their post-endocytotic sorting, accompanied by a disruption of calcium homeostasis. This work sets the basis 10 for further studies on the mechanisms underlying the SE-evoked alterations in hippocampal neurons. A better understanding of these mechanisms may provide new targets for the therapy of SE and strategies for preventing the development of chronic epilepsy
Description: Dissertação de mestrado em Investigação Biomédica, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/29898
Rights: embargoedAccess
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