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dc.contributor.advisorCosta, José Manuel Nascimento-
dc.contributor.advisorRibeiro, Ana Bela Sarmento-
dc.contributor.authorSantos, Catarina Isabel Batista Geraldes dos-
dc.date.accessioned2015-11-05T23:27:53Z-
dc.date.available2015-11-05T23:27:53Z-
dc.date.issued2016-05-25-
dc.date.submitted2015-11-05-
dc.identifier.citationSANTOS, Catarina Isabel Batista Geraldes dos - Alterações moleculares e celulares no mieloma múltiplo : implicações clínicas e terapêuticas. Coimbra : [s.n.], 2016. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/29863-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10316/29863-
dc.descriptionTese de doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Medicina, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra-
dc.description.abstractO mieloma múltiplo sintomático (MM) é uma discrasia de plasmócitos consistentemente precedida por uma entidade pré-neoplásica, designada gamapatia monoclonal de significado indeterminado (MGUS), com uma fase intermédia de mieloma múltiplo indolente (MMI). A expressão de moléculas envolvidas na apoptose, no ciclo celular, na angiogénese e na resistência, nos plasmócitos dos doentes com gamapatias monoclonais (GM), assim como o estado de metilação de genes relacionados com estes mecanismos não estão totalmente conhecidos. O nosso objetivo foi analisar e comparar os parâmetros referidos, nos subgrupos de GM, de modo a identificar novos biomarcadores de diagnóstico e de prognóstico, relevantes na etiopatogenia das GM e na progressão de MGUS para MM. Outro objetivo consistiu em avaliar os efeitos de novos fármacos, dirigidos a alvos moleculares e com mecanismos de ação relacionados, em monoterapia e em associação com o bortezomib, numa linha celular de MM. Deste modo, estudámos amostras de medula óssea de 142 doentes com GM ao diagnóstico (62 doentes com MM, 12 com MMI, 68 com MGUS), de cinco doentes com MM em recidiva ou refratário (MMRR) e de 11 controlos não neoplásicos. Avaliámos a expressão de proteínas pró-apoptóticas, BAX, TRAIL, TRAIL-R1, -R2, FAS, FAS Ligando, caspase 3, TNF-α e recetor 1 do TNF-α; proteínas antiapoptóticas, BCL-2, survivina, TRAIL-R3 e -R4; reguladoras do ciclo celular, P53 e ciclina D1; da angiogénese e da inflamação, VEGF, IL-6 e os seus recetores (VEGF-Rec2 e IL-6Rec); conjugados de ubiquitina; NF-κB e proteínas da família ABC, MRP-1 e gp-P, por citometria de fluxo, nos plasmócitos com fenótipos tumoral (CD138+/CD19-) e não tumoral (CD138+/CD19+) de doentes com GM e de controlos. O perfil de metilação das regiões promotoras de genes com funções moduladoras da apoptose (DAPK, recetores do TRAIL, R1, R2, R3 e R4) e reguladoras do ciclo celular (p15, p16 e p53) foi avaliado por PCR específico de metilação (MS-PCR). Analisámos os efeitos citotóxicos e antiproliferativos de novos fármacos (partenolide, elotuzumab, everolimus, silibinina, ácido gambógico, tricostatina A e decitabina), bem como o seu potencial efeito sinérgico com o bortezomib recorrendo a uma linha celular de MM, as células NCI-H929. A viabilidade celular foi avaliada pelo teste da resazurina; o tipo de morte celular, recorrendo à dupla marcação com anexina V e iodeto de propídeo, e a expressão de caspases ativadas, foram analisados por citometria de fluxo. Os nossos estudos mostram que os plasmócitos CD138+/CD19- dos doentes com GM apresentam, no geral, diminuição da expressão das moléculas pró-apoptóticas, o que pode favorecer a sua resistência à apoptose e contribuir para a mielomagénese. A análise multivariada identificou o aumento da expressão de TRAIL-R2, P53, VEGF-Rec, MRP-1 membranar e gp-P citoplasmática, assim como a redução de ciclina D1 nos plasmócitos CD138+/CD19+, como marcadores com capacidade preditora independente de diagnóstico de GM, podendo estar implicados na sua etiopatogenia. Nos doentes com MGUS observámos aumento da expressão de TRAIL-R2 e FAS, assim como diminuição de TRAIL–R3 e VEGF nos plasmócitos CD138+/CD19+, relativamente aos tumorais (p<0,05). Nos doentes com MM, verificámos que os plasmócitos CD138+/CD19+ apresentam um aumento da expressão de TRAIL-R3, TNF-α, P53 e NF-κB e uma diminuição da expressão de VEGF, quando comparados com os plasmócitos CD138+/CD19- (p<0,05). Além disso, em análise multivariada, verificámos que a diminuição da expressão de TRAIL-R2, survivina, ciclina D1 e gp-P citoplasmática, bem como o aumento de gp-P membranar nos plasmócitos CD138+/CD19+ de doentes com MM, apresentam potencial discriminatório entre MGUS e MM. Nos plasmócitos CD138+/CD19-, apenas o TRAIL-R2 e o VEGF apresentam esse potencial. Nestes plasmócitos o aumento da expressão de caspase 3 nos doentes com MM foi identificado como um marcador de falência de resposta; a diminuição da expressão de VEGF e o aumento da expressão de FAS, FAS ligando, TRAIL e NF-κB foram associados a benefício na sobrevivência global (SG) e, no caso do NF-κB, também a melhor resposta ao bortezomib, realçando a importância destas moléculas na agressividade e na evolução do MM. Os estudos de metilação mostram que 81% dos doentes com GM apresentam, pelo menos, um gene metilado, e 54% dois genes metilados, dos oito estudados; o TRAIL-R3 é o gene que se encontra mais frequentemente metilado (61%). Não se observaram diferenças entre subgrupos de GM, sugerindo que a metilação anómala, apesar de frequente, não parece ser determinante na progressão de MGUS para MM. Nos doentes com MM, a metilação de TRAIL-R3 foi associada a maior probabilidade de recidiva, sem impacto na SG. Os estudos in vitro para avaliação do potencial terapêutico de novos fármacos dirigidos a alvos moleculares mostram que o everolimus, o partenolide, a silibinina, o ácido gambógico e a decitabina, induzem redução significativa na viabilidade das células NCI-H929, dependente da dose e do tempo, e morte celular predominantemente por apoptose com aumento de caspases. Apenas o partenolide incrementou o efeito citotóxico do bortezomib de forma significativa quando administrados em combinação (p<0,01). Em suma, demonstramos que os plasmócitos não tumorais dos doentes com GM apresentam características moleculares que os diferenciam não apenas dos controlos, mas também dos plasmócitos tumorais destes doentes, parecendo influenciar a etiopatogenia das GM e a progressão de MGUS para MM, enquanto as características moleculares dos plasmócitos tumorais parecem ser mais relevantes na resposta à terapêutica e na sobrevivência. O nosso estudo permitiu a identificação de novos biomarcadores moleculares com potencial diagnóstico e prognóstico nas GM. As análises in vitro mostram que a associação do partenolide com o bortezomib poderá contribuir para ultrapassar as resistências a este fármaco e constituir uma nova estratégia terapêutica em doentes com MM.por
dc.description.abstractMultiple myeloma (MM) is a plasma cell dyscrasia consistently preceded by a premalignant disorder called monoclonal gammopahy of undetermined significance (MGUS), with an intermediate phase of smoldering myeloma (SMM). The expression of molecules involved in apoptosis, cell cycle, angiogenesis and resistance in plasma cells from monoclonal gammopathies’ (MG) patients, as well as the methylation status of genes related with these mechanisms are largely unknown. Our aim was to analyse and compare the mentioned parameters in MG subgroups, in order to identify new diagnostic and prognostic biomarkers, relevant in the etiopathogeny of MG and in the progression from MGUS to MM. Another aim consisted in evaluating the effects of new agents with related mechanisms os action, in monotherapy and in association with bortezomib in a MM cell line. In order to achieve these aims, we studied bone marrow samples from 142 MG patients at diagnosis (62 MM; 12 SMM; 68 MGUS), from 5 patients with relapsed/ refractory MM (RRMM) and from 11 non-neoplastic controls. We evaluated the expression of proapoptotic proteins, BAX, TRAIL, TRAIL-R1, -R2, FAS, FAS Ligand, caspase 3, TNF-α and TNF-α recetor 1; antiapoptotic proteins, BCL-2, survivin, TRAIL-R3 and -R4; cell cycle modulators, P53 and cyclin D1; angiogenesis and inflamation, VEGF, IL-6 and respective receptors (VEGF-Rec2 and IL-6Rec); ubiquitin conjugates; NF-kB and ABC proteins, Pgp and MRP-1, by flow cytometry, in plasma cells with neoplastic (CD138+/CD19-) and non-neoplastic (CD138+/CD19+) phenotype from MG patients and from controls. Methylation status of promoter regions of apoptosis modulator genes (DAPK, TRAIL receptors R1, R2, R3 and R4) and cell cycle regulator genes (p15, p16 and p53) was evaluated by methylation specific PCR (MS-PCR). We analysed the cytotoxic and antiproliferative effects of new agents (parthenolide, everolimus, silibinin, gambogic acid, trichostatin A and decitabine), as well as its potential synergistic effect with bortezomib, in a MM cell line (NCI-H929). Cell viability was assessed by rezasurin assays; the type of cell death (annexin V and propidium iodide stain) and activated caspase expression by flow cytometry Our results show a general decrease in proapoptotic molecules expression in CD138+/CD19- plasma cells from MG patients, that may contribute to apoptosis resistance and myelomagenesis. Multivariate data analysis identified the increased expression levels of TRAIL-R2, P53, VEGF-Rec, membrane MRP-1 and cytoplasmic Pgp as well as the decreased expression levels of cyclin D1 as independente predictor biomarkers of MG diagnosis and might be implicated in MG etiopathogenesis. In MGUS patients, we observed an increased expression of TRAIL-R2, FAS, P53 and VEGF-Rec, as well as a decreased expression of TRAIL-R3 and VEGF in non-neoplastic compared to neoplastic plasma cells (p<0,05). In MM patients, we found that CD138+/CD19+ plasma cells presented increased expression levels of TRAIL, TRAIL-R2, FAS, caspase 3, TNF-α, P53 and NF-kB and decreased expression of VEGF and VEGF-Rec, compared to CD138+/CD19- plasma cells (p<0,05). In CD138+/CD19+ plasma cells, we identified in multivariate analysis that the decreased expression of TRAIL-R2, survivin, cyclin D1 and cytoplasmic Pgp as well as the increased expression of membrane Pgp in MM patients present discriminatory potential between MGUS and MM. In CD138+/CD19-, only TRAIL-R2 and VEGF-Rec presented the same potential. In neoplastic plasma cells from MM patients, increased expression of caspase 3 was identified as a biomarker of treatment failure; the decreased expression of VEGF and the increased expression of FAS, FAS ligand, TRAIL and NF-kB were associated to a better overall survival and concerning NF-kB also to a better response to bortezomib, emphasizing the importance of theses molecules in the prognosis of MM patients. Methylation studies showed that 81% of MG patients present at least one and 54% at least two genes hypermethylated from the eight studied genes; TRAIL-R3 is the most frequently methylated gene (61%). No differences between MG subgroups were observed, suggesting that aberrante methylation, although frequent does not seem to be relevant in the progression from MGUS to MM. In MM patients, TRAIL-R3 methylation was associated to an increased risk of relapse; however no impact in overall survival was seen. In vitro studies to evaluate the therapetic potential of new agents directed to molecular targets showed that everolimus, parthenolide, silibinin, gambogic acid, trichostatin A and decitabine in high dosis induced a significant decrease in NCI-H929 cell viability, time and dosis dependent and cell death predominantly due to caspase dependent apoptosis. Parthenolide was the only agent that increased the cytotoxic effect of bortezomib (p<0,01). In summary, we demonstrate that non-neoplastic plasma cells from MG patients present distinct molecular characteristics from controls and from neoplastic plasma cells of the same patients that may influence the etiopathogenesis od MG and the progression from MGUS to MM. Molecular characteristics of neoplastic plasma cells seem to be more relevant in treatment response and survival. Our study allowed the identification of new molecular biomarkers with diagnostic and prognostic potential in MG. In vitro studies show that the association of parthenolide to bortezomib might overcome bortezomib resistance and represent a new therapeutic strategy.-
dc.language.isoporpor
dc.rightsopen access-
dc.subjectmieloma múltiplopor
dc.subjectgamapatia monoclonal de significado indeterminadopor
dc.subjectapoptosepor
dc.subjectepigenéticapor
dc.subjectmetilaçãopor
dc.subjectresistênciapor
dc.subjectnovas terapêuticaspor
dc.subjectmultiple myeloma-
dc.subjectmonoclonal gammopathy of undetermined significance-
dc.subjectapoptosis-
dc.subjectepigenetics-
dc.titleAlterações Moleculares e Celulares no Mieloma Múltiplo - Implicações Clínicas e Terapêuticaspor
dc.typedoctoralThesispor
Appears in Collections:FMUC Medicina - Teses de Doutoramento

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