Biochemical and interactomic characterization of SAPAP3 - a scaffolding protein involved in obsessive-compulsive disorder

Abstract

O gene SAPAP3 codifica uma proteína de suporte da densidade pós-sináptica, expressa em abundância na região do estriado, desempenhando funções importantes na regulação das sinapses glutamartérgicas cortico-estriatais. Os resultados obtidos a partir da caracterização de um modelo animal no qual este gene foi deletado sugerem o envolvimento da SAPAP3 na etiologia do transtorno obsessivo compulsivo. Os animais homozigóticos para a deleção deste gene apresentam elevados níveis de ansiedade, e é observado um comportamento ritualístico que leva a lesões na pele e à perda de pêlo na região facial. Ambos os comportamentos apresentam melhorias significativas após a administração de inibidores de recaptação de serotonina. Os animais mutantes revelam ainda alterações nas sinapses cortico-estriatais, parte do circuito envolvido no transtorno obsessivo compulsivo, e a expressão seletiva de SAPAP3 no estriado provoca a recuperação a nível sináptico e comportamental. Recentemente, esta proteína foi também associada a esquizofrenia, onde várias mutações foram identificadas em pacientes com esta patologia. A produção da SAPAP3 em sistema heterólogo não foi descrita até ao momento, provavelmente devido ao seu elevado tamanho e à falta de domínios anotados, limitando a capacidade de obter informação relativa a esta proteína. Por forma a identificar domínios solúveis da SAPAP3 produzidos em E. coli, foi utilizada uma tecnologia designada ESPRIT (“expression of soluble proteins by random incremental truncation”). Usando esta tecnologia, 28 000 clones foram investigados tendo sido selecionados 96 para expressão em pequena escala. A partir desta informação, o domínio com maior rendimento de proteína solúvel – o domínio 19, correspondente ao C-terminal – foi produzido em larga escala e o seu protocolo de purificação optimizado. Depois de avaliada a qualidade da proteína purificada por técnicas analíticas, foram também iniciados ensaios preliminares de cristalização para determinação da estrutura tridimensional por difração de raios-X, tendo-se obtido putativos cristais em algumas das condições testadas. Numa tentativa de obter novos dados relativos ao papel desta proteína, assim como elucidar os mecanismos moleculares que associam a SAPAP3 ao transtorno obsessivo compulsivo e esquizofrenia, foi realizada igualmente uma caracterização funcional avaliando o interactoma do domínio 19 da SAPAP3, assim como de dois mutantes desta proteína, um mutante envolvido no transtorno obsessivo-compulsivo (K910R) e outro em esquizofrenia (R770L). O resultado destas análises permitiram identificar uma associação entre a SAPAP3 e componentes relacionados com a mitocôndria. Até ao momento este é o primeiro trabalho que descreve este tipo de associação, a qual poderá fornecer novos dados relativos ao envolvimento da SAPAP3 na patofisiologia do transtorno-obsessivo compulsivo e esquizofrenia.

SAPAP3 gene encodes a postsynaptic scaffolding protein, highly expressed in the striatum and important in regulating glutamatergic corticostriatal synapses. Results from a knockout animal model suggest that SAPAP3 may be involved in the pathophysiology of obsessive-compulsive disorder (OCD). Mice homozygous for the gene deletion exhibited increased anxiety and excessive grooming leading to facial hair loss and skin lesions; both behaviors were alleviated by administration of a serotonin uptake inhibitor. Additionally, the mutant mice reveals defects on corticostriatal synapses, part of the circuitry implicated in OCD, and the selective expression of SAPAP3 in the striatum rescues the synaptic and behavioral defects. More recently, human SAPAP3 was also associated with schizophrenia, with several missense mutations identified in patients suffering from such conditions. SAPAP3 protein has not been able to be produced in heterologous systems, probably due to its large size and lack of annotated domains, limiting the ability to obtain more information regarding this protein. In this work, we used the high-throughput screening technology ESPRIT (expression of soluble proteins by random incremental truncation) to identify SAPAP3 soluble domains in E. coli. 28 000 clones were initially screened and 96 selected for small-expression assays. From there, one domain with higher yields of accumulation of soluble protein – C-terminal domain 19 – was produced in larger scale and protein purification methods optimized. After quality control assessment by analytical approaches, preliminary crystallization trials were started, in order to determine its three dimensional structure by x-ray diffraction methods, with several crystals being observed in some of the conditions tested. To get new insights into the role of SAPAP3 and to help in the elucidation of the molecular mechanisms that associate SAPAP3 with OCD and schizophrenia, a functional characterization was performed, by the analysis of SAPAP3 domain 19 interactome, along with the interactome from two SAPAP3 mutants, one mutant associated with OCD (K910R) and another associated with schizophrenia (R770L). Results from these analysis revealed an association between SAPAP3 and mitochondria related components. To our knowledge, this is the first study presenting, what we believe to be, a novel role for SAPAP3 through the identified interaction with mitochondria components, which could also contribute to the understanding of the OCD and schizophrenia pathophysiology.