Microglia as cellular targets for immunomodulation during neurodevelopment

Abstract

A dexametasona (DEX) é um glucocorticóide sintético frequentemente usado na prática clínica para prevenir as complicações respiratórias associadas a partos prematuros. Contudo, indivíduos tratados com este imunossupressor têm tendência a ser patologicamente ansiosos e suscetíveis à depressão. Estudos com modelos animais mimetizando esta terapia mostram que a DEX in utero (iuDEX) tem efeitos prejudiciais no sistema nervoso central (CNS), tais como apoptose neuronal, perda sinática e atrofia dendrítica. O mecanismo responsável por estes efeitos ainda não se encontra esclarecido. A microglia surge como um potencial candidato para mediar os efeitos mencionados porque, além de possuir recetores de glucocorticóides (GR), é uma célula fundamental durante o neurodesenvolvimento, participando na formação e eliminação de sinapses. Além disso, já foi demonstrado que a iuDEX altera a morfologia da microglia no dia pós-natal (PND) 1, 7 e 90. A dinâmica microglial é controlada pelos recetores de adenosina A2A (A2AR), também envolvidos na fisiopatologia da ansiedade e depressão e nas alterações da ramificação dendrítica presentes em indivíduos com stress. Em primeiro lugar, um estudo foi conduzido in vitro para avaliar se a DEX (1 μM) poderia ter um efeito direto na morfologia de células da microglia (linha celular N9) e para avaliar se o bloqueio dos A2AR modularia os efeitos da DEX (utilizando o antagonista seletivo SCH58261, 50 nM). Experiências in vivo foram realizadas com fêmeas de ratos Wistar expostas a iuDEX no dia embrionário (ED) 18 e19 (1 mg/kg/dia subcutaneamente [sc] a fêmeas de rato grávidas) e cronicamente tratadas com SCH58261 (0.1 mg/kg/dia intraperitonealmente [ip]) ou salino, com vários objetivos: (1) avaliar o papel fisiológico dos A2AR no controlo da morfologia da microglia; e (2) avaliar se o bloqueio dos A2AR é eficaz na reversão dos efeitos mediados pela DEX na morfologia da microglia no córtex prefrontal (PFC), uma região do cérebro com um papel central em distúrbios de humor. Paralelamente, foi considerado relevante (3) avaliar o impacto da iuDEX na densidade de A2AR e GR, avaliada em várias regiões do cérebro; e (4) efetuar análises de correlação entre os níveis de corticosterona (CORT, o glucocorticóide fisiológico em roedores) no plasma e (a) o fenótipo comportamental – ansiedade e depressão (dados não publicados) – e (b) o ciclo reprodutivo (denominado ciclo éstrico em roedores). Em estudos preliminares in vitro, a DEX tendeu a alterar o rácio entre células ramificadas e amebóides, o que foi prevenido pela pré-incubação com o antagonista dos A2AR. Animais expostos a iuDEX exibiram diferenças na densidade de GR e A2AR, dependendo da região do cérebro analisada. A análise morfométrica revelou que a iuDEX afeta a morfologia da microglia, diminuindo globalmente tanto o número como o comprimento das ramificações. O bloqueio dos A2AR per se diminuiu o número e comprimento dos processos, um efeito exacerbado em animais previamente expostos a iuDEX. Animais sujeitos a iuDEX apresentaram níveis alterados de CORT no plasma, o que também foi observado em animais cronicamente tratados com SCH58261 na idade adulta. Adicionalmente, os resultados indicam que o comportamento de fêmeas de rato não esteve correlacionado com o ciclo éstrico ou com os níveis de CORT. Em conjunto, estes resultados indicam que o sistema adenosinérgico é alterado pela iuDEX. Os dados demonstram também que a microglia não é apenas afetada pela iuDEX em fases iniciais da vida, mas que estas alterações permanecem na idade adulta. Além disso, a morfologia da microglia está também alterada na idade adulta pelo bloqueio dos A2AR, revelando um papel bastante importante destes recetores numa situação fisiológica. Palavras-chave: Microglia, Neurodesenvolvimento, Dexametasona, Recetores de adenosina A2A.

Dexamethasone (DEX) is a synthetic glucocorticoid o ften used in the clinical practice to prevent the respiratory complications associated wi th preterm deliveries. However, subjects treated with this immunosupressor tend to be pathologically anxious and liable to depression. Studies with animal models mimicking this therapy have reported that in utero DEX ( iu DEX) has deleterious effects on the central nervous system (CNS), such as neuronal apoptosis, synaptic loss and dendritic atrophy. The mechanism responsible for these effects remains unclear. Micr oglia emerge as potential candidates for mediating the aforementioned alterations becaus e, besides having functional glucocorticoid receptors (GR), they are fundamental cells during neurodevelopment, participating in the formation and elimination of s ynapses. Moreover, it has been shown that iu DEX alters microglia morphology at post-natal day ( PND) 1, 7 and 90. Microglial dynamics is controlled by adenosine A 2A receptors (A 2A R), also involved in the pathophysiology of anxiety and depression and in th e alterations of dendritic branching present in stressed individuals. First, a study was conducted in vitro to assess if DEX (1 μ M) could have a direct impact on microglial cells (N9 cell line) morphology and t o evaluate the ability of A 2A R blockade to modulate DEX effects (using the selecti ve antagonist SCH58261, 50 nM). In vivo experiments were performed using female Wistar rat s exposed to iu DEX on embryonic day (ED) 18 and 19 (1 mg/kg/day subcutane ously [sc] to pregnant rats) and chronically treated with SCH58261 (0.1 mg/kg/day in traperitoneally [ip]) or saline, with several objectives: (1) to evaluate the physiologic al role of A 2A R in the control of microglial morphology; and (2) to evaluate the abil ity of A 2A R blockade to revert DEX- mediated effects on microglial morphology in the pr efrontal cortex (PFC), a core brain region in mood disorders. In parallel, it was consi dered of relevance (3) to evaluate the impact of iu DEX on the density of A 2A R and GR, screened throughout different brain regions; and (4) to perform correlation analyses be tween the corticosterone (CORT, the physiological glucocorticoid in rodents) levels in the serum and (a) the behavioural phenotype – anxiety and depression (unpublished dat a) – and (b) the reproductive cycle (termed estrous cycle, in rodents). In preliminary in vitro studies, DEX tended to alter the ramified to amoeb oid cells ratio, which was reversed by pre-incubation with the A 2A R antagonist. Animals exposed to iu DEX exhibited differences in the density of GR and A 2A R, which were dependent on the brain region analysed. The morphometric analysis revealed that iu DEX affected microglial morphology, globally decreasing both the number and length of b ranches. A 2A R blockade per se diminished the number and length of processes, an e ffect exacerbated in animals previously exposed to iu DEX. Animals subjected to iu DEX presented altered levels of serum CORT, which was also observed in animals chronically treated with the A 2A R antagonist at adulthood. Additionally, the results indicate that the behavio ur of the female rats was not correlated with estrous cycle or CORT levels. Altogether, these results indicate that the adenosi nergic system is altered by iu DEX. Data also demonstrate that microglia is not only af fected by iu DEX in the early stages of life, but that these alterations persist in adul thood. Moreover, microglia morphology is also considerably altered by the blockade of A 2A R in adulthood, revealing a quite important role for these receptors in a physiologic al situation.