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Title: Dissecting the role of Hes5 in cardiogenesis
Authors: Silva, Francisca Castro Gomes Soares da 
Orientador: Freire, Ana Gonçalves
Girão, Henrique
Keywords: Cardiogénese; Embriologia
Issue Date: 11-Sep-2015
Citation: SILVA, Francisca Castro Gomes Soares da - Dissecting the role of Hes5 in cardiogenesis. Coimbra : [s.n.], 2015. Dissertação de mestrado. Disponível na WWW em: <http://hdl.handle.net/10316/29716>.
Abstract: Heart formation involves the participation of various signaling pathways that crosstalk in a temporal and context–dependent manner. The molecular events taking place from pre-gastrulation up to formation of cardiomyocytes are recapitulated in vitro by differentiating mouse embryonic stem (mES) cells. Importantly, by closely following the kinetics of cell fate decisions occurring in the embryo, ES cells facilitate mechanistic studies aimed at the dissection of early lineage specification. Following previous findings demonstrating the role of the Notch pathway in specifying a cardiac fate from mesodermal progenitors and hemangioblasts1, our laboratory identified a novel function for Hes5, as a downstream effector of Notch1, at the onset of cardiogenesis (Freire, AG et al, unpublished). Loss and gain of function studies unveiled that Hes5 instructs ES cell-derived mesodermal progenitors to commit preferentially towards cardiac over a hematopoietic fate, in part by regulating the early cardiac transcription factor, Isl1. Interestingly, a short-pulsed Hes5 induction enhances cardiac specification, whereas a sustained activation impairs the emergence of contracting colonies. The herein Thesis aimed to further dissect the role of Hes5 in cardiogenesis. To this end, we proposed to understand the role of this bHLH regulator at different stages of the cardiomyocytic program. Given the robustness of the mES cell in vitro model system for cardiac differentiation, a mES cell line expressing exogenous Hes5 under the control of a Doxycycline (Dox)-inducible promoter was used. The data indicated that Hes5 expression maintains an undifferentiated cardiac progenitor state, in part by sustaining high Isl1 levels. These results demonstrated that after induction of cardiac fate, Hes5 withdrawal is required to allow cardiac differentiation, suggesting a confined transient temporal window for Hes5 participation in cardiogenesis. A second aim of this Thesis was the characterization of endogenous Hes5 expression during mES cell differentiation towards mesodermal derivatives, in a more close to physiological system. Interestingly, Hes5 levels upregulated from day 4 to day 6 of in vitro differentiation, correlating to the temporal window identified for enhanced cardiac differentiation induced by transient exogenous Hes5 overexpression. x Finally, aiming at the validation of Hes5 role in specifying cardiac fate in the developing mouse embryo, Hes5 expression was assessed in E6.5 and E7.5 mouse embryos. These results report for the first time Hes5 expression in the nascent mesoderm of gastrulating E6.5 embryos. Interestingly, Hes5 expression was not found or dramatically reduced in E7.5 embryos, further corroborating a transient role for Hes5 at the onset of cardiogenesis. Overall, the work performed in the frame of the herein Thesis contributed (i) a better understanding of Hes5 role at different stages of the cardiomyocytic differentiation program (i.e. at the specification of cardiac progenitors and during differentiation into cardiomyocytes), (ii) the indication that endogenous Hes5 is upregulated at the time cardiac progenitors are specified during in vitro mES cell differentiation, and (iii) the first report of Hes5 expression in the nascent mesoderm of E6.5 gastrulating embryos.
A formação do coração envolve a participação de várias vias de sinalização que interagem entre si de um modo tempo- e contexto-dependente. Os eventos moleculares que ocorrem desde a pré-gastrulação até à formação de cardiomiócitos são recapitulados in vitro através da diferenciação de células estaminais embrionárias (CEEs). Importante ainda é que, ao acompanharem de perto a cinética das decisões de destino celular que ocorrem no embrião, as EECs facilitam a execução de estudos mecanísticos com o objectivo de dissecar a especificação das linhagens celulares. Dado o papel, previamente demonstrado, da via de sinalização Notch na especificação de um destino cardíaco a partir de progenitores da mesoderme e hemangioblastos, o nosso laboratório identificou uma nova função para o Hes5, como efector do Notch1, na indução da cardiogénese (Freire, AG et al, não publicado). Estudos de perda e ganho de função revelaram que o Hes5, em parte por regular os níveis do factor de transcrição Isl1, determina uma decisão preferencial pela diferenciação em linhagens cardíacas em detrimento de hematopoiéticas nos progenitores da mesoderme derivados de CEEs. Interessantemente, a indução de um pulso curto de Hes5 aumenta a especificação cardíaca, enquanto que uma activação contínua diminui o aparecimento de colónias a contrair. Esta dissertação de Mestrado teve como objectivo dissecar o papel do Hes5 na cardiogénese. Com este propósito, propusemos compreender o papel deste factor de transcrição em diferentes etapas do programa de diferenciação cardiomiocítico. Dada a robustez do modelo in vitro de diferenciação de CEEs em células cardíacas, foi utilizada uma linha celular estaminal embrionária que expressa Hes5 exógeno sob o controlo de um promotor indutível de Doxiciclina (Dox). Os dados obtidos indicam que a expressão de Hes5 mantém as células num estado de progenitores cardíacos indiferenciados, em parte por manter os níveis de Isl1 também elevados. Estes resultados demonstraram que após a indução de um destino cardíaco é necessária uma diminuição de expressão de Hes5 para permitir diferenciação cardíaca, sugerindo que a participação do Hes5 na cardiogénese ocorre numa janela temporal transiente. xii Um segundo objectivo desta dissertação incluiu a caracterização da expressão de Hes5 endógeno durante a diferenciação in vitro de derivados da mesoderme, num sistema mais próximo do fisiológico. Interessantemente, os níveis de Hes5 aumentam desde o dia 4 até ao dia 6 de diferenciação in vitro, o que correlaciona com a janela temporal previamente identificada por indução de expressão de Hes5 exógeno na qual o Hes5 aumenta a diferenciaçao cardíaca. Finalmente, a expressão de Hes5 foi avaliada em embriões de murganho com 6,5 e 7,5 dias com o objectivo de validar o papel do Hes5 na especificação de um destino cardíaco no desenvolvimento embrionário de murganho. Estes resultados descrevem pela primeira vez expressão de Hes5 na mesoderme nascente de embriões com 6,5 dias. Importante ainda, é o facto de a expressão de Hes5 não ter sido detectada, ou estar dramaticamente reduzida em embriões com 7,5 dias, corroborando o papel transiente do Hes5 na indução da cardiogénese. Em resumo, o trabalho realizado no âmbito da presente dissertação contribuiu (i) um melhor conhecimento do papel do Hes5 em diferentes etapas do programa de diferenciação cardiomiocítio (i.e. na especificação de progenitores cardíacos e durante a diferenciação em cardiomiócitos), (ii) a indicação que a expressão de Hes5 endógeno está aumentada durante o tempo de especificação dos progenitores cardíacos durante a diferenciação in vitro de CEEs, e (iii) uma primeira descrição de expressão de Hes5 na mesoderme nascente em embriões com 6,5 dias.
Description: Dissertação de mestrado em Investigação Biomédica, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/29716
Rights: embargoedAccess
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UC - Dissertações de Mestrado

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