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Title: Microarray-based detection of antibiotic resistance and virulence factor genes in Salmonella spp. isolated from food-producing animals and processed food
Authors: Figueiredo, Rui Filipe Ramos 
Orientador: Silva, Gabriela
Mendonça, Nuno
Keywords: Antimicrobial resistance; Virulence; Salmonella; Food; Animal
Issue Date: 5-May-2016
Citation: FIGUEIREDO, Rui Filipe Ramos - Microarray-based detection of antibiotic resistance and virulence factor genes in Salmonella spp. isolated from food-producing animals and processed food. Coimbra : [s.n.], 2016. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/29327
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/78833/2011/PT/MICROARRAY-BASED DETECTION OF ANTIBIOTIC RESISTANCE AND VIRULENCE FACTORS GENES OF SALMONELLA SPP. ISOLATED FROM FOOD-PRODUCING ANIMALS AND PROCESSED FOOD 
Abstract: Salmonella enterica é uma bactéria patogénica de origem alimentar que infecta seres humanos pelo mundo inteiro. Nalguns casos, as infeções por Salmonella requerem tratamento com antibióticos. A resistência a agentes antimicrobianos é um problema global e leva ao insucesso do tratamento de infeções bacterianas. Alguns estudos têm sido realizados em Portugal na resistência a antimicrobianos e metais pesados em Salmonella de origem animal e alimentar. E poucos estudos de virulência têm sido efetuados até ao momento em Portugal. Este trabalho teve assim como objetivo o estudo fenotípico e genotípico de genes de resistência a antibióticos e metais pesados. Por outro lado, um novo DNA microarray foi desenhado e validado para avaliar a virulência de isolados de Salmonella spp. recolhidos de animais e alimentos de origem animal. Um total de 14 serótipos foi identificado, dos 258 isolados recolhidos, sendo S. Typhimurium (32.6%) e S. Enteritidis (10.1%) os mais comuns. A maioria dos isolados (70.2%) era resistente a pelo menos uma classe de antibióticos, apresentando uma maior frequência de resistência à tetraciclina (47.7%) e ampicilina (36.0%). A resistência às fluoroquinolonas foi verificada em 8% dos isolados. S. Enteritidis possuía ESBL blaSHV-12 num plasmídeo conjugativo IncI. Um subgrupo de 106 isolados de S. enterica foi selecionado, que incluía S. Typhimurium, S. Enteritidis, e outros isolados resistentes a antibióticos pertencentes a serótipos menos comuns. O perfil genético de resistência a antibióticos foi efetuado com recurso a microarrays para genes de resistência a antibióticos. Verificou-se que 65.1% destes isolados apresentavam resistência à tetraciclina conferida por tet(B), e 58.8% à ampicilina, principalmente devido à presença de blaTEM-type e blaPSE-type. A resistência a metais pesados foi detetada pela sequenciação completa do genoma, e estudos fenotípicos e sua capacidade de disseminação foi feita por conjugação com Escherichia coli. Um isolado multirresistente S. Typhimurium Sal25, apresentava resistência aos metais pesados, e assim como a presença da ESBL blaCTX-M-1 num plasmídeo conjugativo IncHI2, plasmídeo esse que possuía vários genes de resistência a metais pesados como telurite, zinco, cobre, cobalto, arsénio, mercúrio, prata e cádmio. Este trabalho descreveu pela primeira vez S. Typhimurium com blaCTX-M-1 em Portugal. A estirpe S. Typhimurium Sal368 mostrou também pela primeira vez em Salmonella, a presença do gene tet(M) inserido na transposase Tn3 num plasmídeo IncF que também albergava os genes de resistência a arsénio, mercúrio e prata. Os plasmídeos IncHI2 e IncF foram facilmente transferidos por conjugação para E. coli. Nos estudos de virulência, os mesmos 106 isolados foram estudados. Genes das ilhas de patogenicidade (SPI) e genes de adesão muito conservados enquanto genes de profágos e plasmídeos de virulência eram variáveis. Resultados atípicos de microarrays levaram à sequenciação do genoma do isolado S. Infantis Sal147, onde se identificou a deleção de 35 genes da SPI-1. Ensaios de adesão/invasão foram efetuados em células de cólon humano, HT-29, e o isolado mostrou capacidade para aderir mas não para entrar nas células HT-29. Estudos subsequentes efetuados in vivo em larvas de Galleria mellonella demonstraram reduzida capacidade de mortalidade em comparação com uma estirpe de S. Infantis com SPI-1 completa. A análise de microarray e da sequenciação do genoma de S. Typhimurium Sal199 demonstrou pela primeira vez a presença do gene cdtB e outros genes relacionados com S. Typhi, em S. Typhimurium. A caracterização de Sal199 mostrou a localização a montante de uma transposase IS911 e a co-expressão de outros genes relacionados com S. Typhi. Em células HeLa infetadas com Sal199, verificou-se paragem de divisão celular, distensão do citoplasma, e enlargamento do núcleo, resultados não observados aquando da infeção pelas células com controlo S. Typhimurium LT2. Estudos in vivo mostraram um aumento na mortalidade de G. mellonella infetadas com Sal199 em comparação com LT2. Em conclusão, este estudo permitiu uma primeira abordagem a Salmonella que podem infetar seres humanos. Em caso de infeção o tratamento poderia ser ineficaz, e as infeções por Salmonella poderiam ser mais severas. A identificação de estirpes com grande potencial de virulência em alimentos numa fase inicial facilita a intervenção precoce reduzindo o risco de disseminação de estirpes epidémicas. Assim, métodos como DNA microarrays e sequenciação completa do genoma podem ser usados em análises epidemiológicas e surtos de Salmonella. Assim, o uso de métodos de rastreamento de resistência a antibióticos e virulência podem ajudar a perceber os potenciais riscos associados a infeção de humanos por Salmonella.
Salmonella enterica is a foodborne pathogen that infects human with a worldwide distribution. In some cases, Salmonella infection requires antimicrobial treatment. Antimicrobial resistance is a current problem around the world, and causes bacterial treatment failure. Few studies have been performed in Portugal of antimicrobial and heavy metal resistance as well as scarce Salmonella virulence studies were previously done in Salmonella of animal and food origin. This work aimed to study phenotypic and genotypic determinants of antimicrobial and heavy metals resistance, and to screen and characterize virulence genes. A new virulence microarray was designed and validated, and then tested in Salmonella panel of animal and food origin. A total of 14 serotypes were identified, from 258 isolates recovered, being S. Typhimurium (32.6%) and S. Enteritidis (10.1%) the most common. The majority of isolates (70.2%) were resistant at least to one class of antimicrobial agent and showed high frequency of resistance to tetracycline (47.7%) and ampicillin (36.0%). Resistance to fluoroquinolones was found in 8% of isolates. ESBL-producer S. Enteritidis strain carrying blaSHV-12 gene on IncI conjugative plasmid was isolated from poultry. A subset of 106 S. enterica isolates were selected, that included S. Typhimurium, S. Enteritidis, and other antimicrobial resistant (AMR) strains belonging to less common serotypes. AMR profile in 106 Salmonella strains was assessed by AMR microarray. Phenotypic and genotypic AMR testing of this isolates subset detected high levels of resistance to tetracycline (65.1%) and ampicillin (58.8%), mainly due to presence of tet(B), blaTEM-type and blaPSE-type. Heavy metal resistance and associated genetic elements were also detected by whole genome sequencing (WGS). Their transfer was confirmed by conjugation. Multidrug resistant S. Typhimurium Sal25, showing heavy metal resistance, carried blaCTX-M-1 gene on a conjugative IncHI2 plasmid that also harboured a numerous genes encoding resistance to tellurite, zinc, copper, cobalt, arsenic, mercury, silver, and cadmium. This work describes the first report of a blaCTX-M-1 in S. Typhimurium in Portugal. AMR S. Typhimurium Sal368, showed for the first time in Salmonella, the presence of a tet(M) gene inserted within Tn3 transposase in an IncF plasmid that also harboured blaTEM-1 gene and resistance genes to arsenic, mercury, and silver. IncHI2 and IncF plasmids were transferred by conjugation to Escherichia coli. On virulence approach, the same 106 Salmonella strains were studied. Salmonella Pathogenicity islands (SPIs) and adherence genes were highly conserved, while prophages and virulence plasmid genes were variably present. Atypical microarray results lead to WGS of S. Infantis Sal147, which identified deletion of thirty-five SPI-1 genes. Adhesion/invasion studies were performed in human colon cells, HT-29, and Sal147 showed capacity to adhere but not to invade HT-29. Further studies performed in vivo in Galleria mellonella caterpillar showed reduced mortality in comparison to a SPI-1 harbouring S. Infantis. Microarray and WGS of S. Typhimurium Sal199 established for the first time in S. Typhimurium the presence of cdtB and other S. Typhi-related genes. Characterization of Sal199 showed cdtB genes were upstream of transposase IS911 and co-expressed with other Typhi-related genes. In HeLa cells infected by Sal199, morphological cells’ assays showed cell cycle arrest, cytoplasmic distension and nuclear enlargement was detected, but not with S. Typhimurium LT2 control. Studies in vivo showed increased mortality of G. mellonella with Sal199 infection compared to LT2. This work allowed to know that in case of human infection the antibiotherapy can be ineffective, and the Salmonella infection can be more severe. Identification of strains with high virulence potential and infectivity in the food at an early stage may help facilitate interventions reducing the risk of dissemination of epidemic strains. So, tools like DNA microarray and WGS can be used to trace Salmonella outbreaks, and perform epidemiological analysis. These methods for Salmonella AMR and virulence studies can help assess the potential risk associated with certain Salmonella to humans.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Microbiologia e Parasitologia, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/29327
Rights: openAccess
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