Interaction between Cx43 and LC3 directs gap junctions to ubiquitin-independent autophagy degradation

Abstract

Connexin43 (Cx43) is a membrane protein present in gap junctions (GJ) of several tissues, including the heart, where they permit the metabolic and electrical coupling vital for heart contraction. Previous studies carried out in our lab showed that degradation of Cx43 by macroautophagy requires the autophagy adaptor p62, that links the ubiquitinated protein to the nascent autophagosome, through the microtubule-associated protein-1 light chain 3 (LC3). Proteins that interact with LC3, like p62, contain a short hydrophobic LC3-interacting region (LIR). We identified an amino acid sequence in the N-terminus of Cx43 that is consistent with the accepted form for a LIR motif. The main goal of this study was to identify the LIR domain in Cx43 and establish the relevance of the motif for the degradation of Cx43. We hypothesized that the presence of this motif could mediate an alternative form of Cx43 degradation by autophagy that is independent of ubiquitin and p62. Using Cx43 mutanted in the putative LIR domain and through immunoprecipitation assays we evaluated the involvement of the LIR in mediating the direct interaction between Cx43 and LC3 and the influence of p62 in this interaction. Moreover, to investigate the stability of the Cx43 LIR mutants, we performed cycloheximide-chase assays to determine their half-life in several conditions. To evaluate the effect of the mutations in the subcellular distribution of the protein we used immunofluorescence confocal microscopy. Our results showed that Cx43 interacts with LC3 and that mutations in the LIR motif of Cx43 abrogate this interaction. In addition, we demonstrated that these mutants are more stable than wild type Cx43, suggesting that the LIR motif is required for Cx43 degradation. Altogether, the results obtained in this study establish a novel non-canonical pathway of degradation of Cx43 that implies the direct binding of Cx43 to LC3, without the need of ubiquitin and p62.

A conexina 43 (Cx43) é uma proteína transmembranar presente nas gap junctions (GJ) de diversos tecidos, incluindo o coração onde permite o acoplamento metabólico e elétrico vital para o normal funcionamento do coração. Estudos prévios levados a cabo no nosso laboratório mostraram que a degradação da Cx43 por macroautofagia requer a proteína adaptadora p62, que liga proteínas ubiquitinadas ao autofagossoma, através da microtubuleassociated protein-1 light chain 3 (LC3). Proteinas que interagem com a LC3, como o p62, contém uma região hidrofóbica que interage com a LC3 (LIR). A Cx43 contém no seu Nterminal uma sequência de aminoácidos consistente com o estabelecido para um domínio LIR. O principal objectivo deste estudo é a caracterização do domínio LIR na Cx43 e estabelecer a relevância deste na degradação da Cx43 por macroautofagia. A presença deste domínio poderia então mediar a degradação da Cx43 por macroautofagia, de uma forma independente de ubiquitinação e do recrutamento do p62. Para tal, usamos construções de Cx43 mutadas neste possível domínio LIR e através de ensaios de imunoprecipitação avaliamos o envolvimento do LIR na interacção entre a Cx43 e a LC3 e a influência do p62 nesta interacção. Para comparar a estabilidade dos mutantes da Cx43 no dominio LIR, levamos a cabo ensaios de cycloheximide chase para determinar o tempo de meia vida da proteína, em diferentes condições. A avaliação da distribuição subcelular da proteina foi feita através de imunofluorescência. Os nossos resultados demostram que a Cx43 interage com a LC3 e que as muatações no domínio LIR levam a uma diminuição desta interacção. Além disso, estes mutantes mostram ser mais estáveis que a Cx43 não mutante, sugerindo que o motivo LIR é importante na degradação da Cx43. Em suma, os resultados obtidos neste estudo sugerem uma nova via não-canónica para a degradação da Cx43, que implica a ligação direta entre Cx43 e LC3, sem a necessidade de ubiquitinação prévia e do recrutamento do adaptador p62.