Please use this identifier to cite or link to this item:
https://hdl.handle.net/10316/28931
Title: | Development of non-viral vectors based on poly(β-amino esters) segments for gene delivery | Authors: | Cordeiro, Rosemeyre Amaral | Orientador: | Coelho, Jorge Serra, Arménio |
Issue Date: | 12-Nov-2015 | Citation: | CORDEIRO, Rosemeyre Amaral - Development of non-viral vectors based on poly(β-amino esters) segments for gene delivery. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/28931 | Abstract: | A terapia génica tem atraído um grande interesse nas últimas décadas como sendo
uma técnica altamente promissora para novos tratamentos de um vasto número de
doenças hereditárias e não hereditárias. Contudo, apesar de todos os esforços nesta
área, o desenvolvimento de uma entrega segura e efectiva continua a ser o principal
desafio para a sua aplicação na clínica. Neste sentido, surgem os vectores não-virais
que oferecem algumas vantagens, como por exemplo, a fácil produção, estabilidade,
baixa imunogenicidade e toxicidade, e grande capacidade de transportar ácidos nucleicos
quando comparados com os vectores virais. Todavia, os actuais sistemas de
entrega não-virais continuam muito menos eficientes que os virais. Entre os vectores
não-virais, os polímeros catiónicos têm surgido como um grupo promissor para a
entrega de genes.
O foco desta tese é o desenvolvimento de um novo e mais eficiente vector
polimérico não-viral de base poli(ester b-amino) (PbAE) e poli(metacrilato
de etilo-2-dimetilamino) (PDMAEMA). Os copolímeros de bloco poli(metacrilato
de etilo-2-dimetilamino)-bloco-poli(ester b-amino)-bloco-poli(metacrilato de etilo-2-
dimetilamino) (PDMAEMA-b-PbAE-b-PDMAEMA) foram preparados por cicloadição
de Huisgen azida-alcino catalizada por cobre (I) (CuAAC). A sua habilidade
para condensar e entregar DNA foi avaliada, primeiramente, para os copolímeros de
bloco PDMAEMA8000-b-PbAE3000-b-PDMAEMA8000 e PDMAEMA3000-b-PbAE3000-
b-PDMAEMA3000 de modo a estudar a influência do peso molecular do segmento
PDMAEMA na capacidade de transfecção. A actividade da transfecção
in vitro foi avaliada nas linhas celulares HeLa e COS-7 e os poliplexos preparados
com o copolímero com segmento de PDMAEMA com menor peso molecular
(PDMAEMA3000-b-PbAE3000-b-PDMAEMA3000) revelaram ter uma maior actividade.
Além disso, comparando os resultados da transfecção dos poliplexos de
base PDMAEMA3000-b-PbAE3000-b-PDMAEMA3000 com dois dos mais utilizados
padrões de reagentes de transfecção, a PEI ramificada 25,000 g.mol-1 (bPEI25000)
e o TurboFectTM, revelaram uma maior actividade em ambas as linhas celulares utilizadas. Contudo, os resultados mostraram também que ambos os complexos
copolímero/DNA induziam alguma citotoxicidade para maiores razões azoto /
fosfato (N/P). Foi hipotetizado que talvez se devesse às quantidades residuais
de cobre utilizado aquando da preparação dos copolímeros. Para ultrapassar
esta questão, os copolímeros de bloco foram preparados através de reacção de
adição de Michael (sem a necessidade de uso de catalizadores metálicos). Nesta
fase foram preparados 3 copolímeros de bloco diferindo os pesos moleculares do
segmento central (PDMAEMA3000-b-PbAE3000-b-PDMAEMA3000, PDMAEMA3000-b-
PbAE9000-b-PDMAEMA3000 e PDMAEMA3000-b-PbAE12000-b-PDMAEMA3000). Após
a incubação dos complexos copolímero/DNA a viabilidade celular foi também avaliada
nas linhas celulares HeLa e COS-7, resultando num dramático aumento da viabilidade
celular nas altas razões de carga copolímero/DNA. Além disso, os ensaios
de transfecção in vitro revelaram grande actividade de transfecção para todos
os copolímeros de bloco testados. A partir destes resultados, concluiu-se que
a melhor formulação era para os complexos de base PDMAEMA3000-b-PbAE12000-
b-PDMAEMA3000), revelando um aumento na actividade de transfecção entre 40
a 60 vezes superior comparado com os reagentes de transfecção padrão, bPEI25000
e TurboFectTM. Quando comparado com o copolímero de bloco mais promissor
preparado através de CuAAC, o copolímero de bloco PDMAEMA3000-b-PbAE12000-
b-PDMAEMA3000 revelou um aumento da actividade de transfecção de 5 e 9 vezes
superior nas linhas celulares COS-7 e HeLa, respectivamente.
Os resultados presentes nesta tese mostram que a combinação do PDMAEMA e
PbAE num único material revela características fisico-químicas e biológicas interessantes,
fazendo deles promissores materiais para entrega de genes. Gene therapy has attracted increasing interest over the past few decades as a highly promising therapeutic technique to provide new treatments for a large number of inherited and acquired diseases. However, despite all efforts in this area, the development of a safe and effective delivery of nucleic acids remains a principal challenge to its application in the clinic. In this sense, non-viral vectors have emerged and offer a number of advantages, including facile production, stability, low immunogenicity and toxicity, and higher capacity to carry nucleic acids compared to viral vectors. Nevertheless, current non-viral delivery systems continue far less efficient than viral ones. Among non-viral vectors, cationic polymers have emerged as a promising group for gene delivery. This thesis is focused on the development of a new and more efficient polymeric nonviral vector based on poly(β-amino ester) (PβAE) and poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate] (PDMAEMA). The poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate]-blockpoly(β-amino ester)-block-poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate] (PDMAEMAb-PβAE-b-PDMAEMA) block copolymers were prepared by copper(I)-catalyzed Huisgen azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). Their ability to condense and deliver DNA was assessed, firstly, for PDMAEMA8000-b-PβAE3000-b-PDMAEMA8000 and PDMAEMA3000-b-PβAE3000-b-PDMAEMA3000 block copolymers in order to study the influence of molecular weight of PDMAEMA segment in transfection capacity. In vitro transfection activity was assessed in HeLa and COS-7 cell lines and showed higher activity for polyplexes based on block copolymer prepared with PDMAEMA segment with lower molecular weight (PDMAEMA3000-bPβAE3000-b-PDMAEMA3000). In addition, comparing PDMAEMA3000-b-PβAE3000- b-PDMAEMA3000-based polyplexes transfection results with two of the most used standard transfection reagents, branched PEI 25,000 g.mol-1 (bPEI25000) and TurboFectTM, revealed higher activity in both cell lines used. However, results also showed that both block copolymer/DNA complexes induced some cytotoxicity for higher nitrogen/phosphate (N/P) ratios. It was hypothesized that could be due to the residual amounts of copper used during copolymers preparation. To overcome this issue, block copolymers were then prepared by Michael addition reaction (without the need of metal catalysts). In this phase, three block copolymers were prepared differing the molecular weights of central segment (PDMAEMA3000-b-PβAE3000- b-PDMAEMA3000, PDMAEMA3000-b-PβAE9000-b-PDMAEMA3000, PDMAEMA3000-bPβAE12000-b-PDMAEMA3000). The cell viability after incubation with copolymer/DNA complexes was also assessed in HeLa and COS-7 cell lines, resulting in a notorious increase of cell viability in high N/P ratios. Moreover, in vitro transfection assays revealed high transfection activities for all block copolymer tested. From these results, it was concluded that PDMAEMA3000-b-PβAE12000-b-PDMAEMA3000/DNA complexes was the best formulation, showing an increase in transfection activity between 40-fold to 60-fold compared with transfection standard reagents, bPEI25000 and TurboFectTM. When compared with the most promising block copolymer synthesized by CuAAC, the PDMAEMA3000-b-PβAE12000-b-PDMAEMA3000 revealed an increase of transfection activity of 5-fold and 9-fold in COS-7 and HeLa cell lines, respectively. The results presented in this thesis demonstrate that the combination of PDMAEMA and PβAE in a single material disclose interesting physicochemical and biological characteristics making it a very promising material suitable for gene delivery. |
Description: | Tese de doutoramento em Engenharia Química, apresentada ao Departamento de Engenharia Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra | URI: | https://hdl.handle.net/10316/28931 | Rights: | embargoedAccess |
Appears in Collections: | FCTUC Eng.Química - Teses de Doutoramento |
Files in This Item:
File | Description | Size | Format | |
---|---|---|---|---|
Development of non-viral vectors.pdf | Tese de doutoramento (documento principal) | 92.9 MB | Adobe PDF | View/Open |
Page view(s)
220
checked on Sep 3, 2024
Download(s) 50
570
checked on Sep 3, 2024
Google ScholarTM
Check
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.