Title: Pesquisa de inibidores enzimáticos em óleos essenciais. Estudo da actividade em BACE-1, uma protease aspártica envolvida na doença de Alzheimer
Authors: Videira, Rita Margarida Almeida Santos 
Orientador: Cavaleiro, Carlos Manuel Freire
Faro, Carlos José Fialho Costa
Keywords: Óleos essenciais;Doença de Alzheimer;Inibidores enzimáticos
Issue Date: 14-Dec-2015
Citation: VIDEIRA, Rita Margarida Almeida Santos - Pesquisa de inibidores enzimáticos em óleos essenciais : estudo da actividade em BACE-1, uma protease aspártica envolvida na doença de Alzheimer. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/28917
Abstract: Os óleos essenciais têm vindo a ser utilizados em terapêutica com uma extensa lista de possíveis aplicações clínicas. Estes produtos de origem vegetal, obtidos quase exclusivamente por destilação, são constituídos por dezenas de compostos de baixa massa molecular e elevada hidrofobicidade, sendo, por isso, importantes fontes de compostos naturais capazes de ultrapassar barreiras fisiológicas e de permear membranas, com potencial intrínseco para interagir e modular alvos intracelulares e exercer efeitos biológicos. Nos últimos anos, as proteases aspárticas mereceram atenção reforçada da comunidade científica por integrarem os mecanismos moleculares de diversas patologias graves e de elevada prevalência, tais como a síndrome da imunodeficiência humana adquirida, a malária, a doença de Alzheimer, algumas infecções fúngicas, etc. A identificação e caracterização de inibidores dessas proteases aspárticas e as suas potencialidades como agentes quimioterapêuticos assumiram, então, grande relevância. É o caso da BACE-1, protease aspártica reconhecida como enzima chave no processo neurodegenerativo da doença de Alzheimer, e dos seus potenciais inibidores que, tendo fins terapêuticos, devem demonstrar, não só, selectividade, mas também características favoráveis para passarem a barreira hemato-encefálica e permearem membranas celulares. Neste contexto, descrevemos nos próximos capítulos a investigação que desenvolvemos com vista à identificação de inibidores da BACE-1, hidrófobos e de baixa massa molecular, aptos para permearem membranas celulares. A primeira fase deste trabalho correspondeu a um rastreio, sobre várias dezenas de óleos essenciais, tendo em vista evidenciar os óleos que demonstravam efeitos inibitórios sobre a proBACE-1 recombinante. Todos os óleos ensaiados foram caracterizados por elucidação da sua composição. Entre os que revelaram capacidade inibitória, o óleo essencial de Lavandula luisieri foi distinguido como o mais promissor, tendo em conta a potência da inibição e a sua composição singular que inclui raros monoterpenos irregulares de núcleo ciclopentano penta-substituído, usualmente designados como monoterpenos derivados do necrodano. O óleo de L. luisieri inibiu a BACE-1 de forma dependente da concentração, tanto em ensaios bioquímicos de inibição in vitro (IC50 de 121,5g.ml-1), como em ensaios de avaliação da redução da produção de A em linhas celulares (EC50 de 86,2g.ml-1) que, simultaneamente, comprovaram a capacidade dos componentes do óleo para permear membranas celulares. Na sequência de fraccionamentos bioguiados, que permitiram a obtenção de fracções com composições menos complexas, aprofundou-se o conhecimento sobre a composição do óleo essencial de Lavandula luisieri, até à data, insuficientemente caracterizado. Foram, então, identificados cerca de uma centena de componentes que representam mais de 85% da composição total. A actividade inibitória das fracções foi avaliada, quer sobre a forma pró-, quer sobre a forma activa da enzima recombinante, caracterizando-se a fracção mais activa (#3.1), maioritariamente constituída por linalol e por um composto de núcleo necrodano, a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona, por valores de IC50 de 282,6g.ml-1 para a inibição enzimática, e de EC50 de 94,5g.ml-1 para a diminuição da produção de A na linha celular CHO-APPwt. O linalol e a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona, isolados a partir do óleo essencial e de origem sintética, foram avaliados isoladamente revelando que a actividade inibitória da fracção se devia à 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona. O linalol não produziu efeito algum nas concentrações testadas. Pelos ensaios de inibição da enzima recombinante com a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona não se evidenciaram diferenças na inibição da forma pró- e da forma activa. De igual modo, quer em termos de potência, quer em termos de modo de inibição não se assinalaram diferenças significativas entre a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona isolada a partir do óleo de L. luisieri e a de origem sintética. Foi determinado um Kiapp de 415,8M, ajustando-se os dados a um modelo de inibição competitivo. A 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona demonstrou capacidade de inibir a produção de A em duas linhas celulares, CHO-APPwt e SHSY5Y-APPwt, com EC50 de 72,8M e 217,4M, respectivamente, e sem alterações significativas da viabilidade celular nas concentrações inibitórias. A inibição da BACE-1 intracelular foi ainda comprovada pela diminuição da produção de sAPP, o produto directo da clivagem do APP por aquela enzima. A principal diferença encontrada nos resultados dos ensaios sobre linhas celulares, relativamente aos ensaios enzimáticos, foi o facto de a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona isolada a partir do óleo de L. luisieri e a sintética não inibirem a produção de A exactamente com a mesma potência, sendo esta muito superior no primeiro caso. O linalol, contaminante residual da 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona isolada, parece desempenhar um papel no efeito celular, já que ao ser adicionado à 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona sintética aumenta ligeiramente a inibição. Na última fase deste trabalho avaliámos a capacidade dos compostos activos, 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona e linalol, diminuírem a produção de A in vivo, utilizando um modelo animal da doença de Alzheimer, o ratinho transgénico 3xTg-AD. Da mesma forma que o observado nas linhas celulares, o óleo total, a fracção e a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona reduziram de forma significativa os níveis de A cerebral (aproximadamente 25% para as concentrações estudadas), sem sinais visíveis de toxicidade, após administração intranasal. Estes resultados permitiram demonstrar que o óleo estudado e alguns dos seus constituintes têm capacidade para inibir a BACE-1 não só in vitro, mas também in vivo, característica essencial para um inibidor com utilidade clínica. Não obstante a falta de selectividade e a potência moderada, o óleo essencial de L. luisieri e alguns dos seus componentes apresentam potencial aplicabilidade como inibidores da BACE-1, quer para fins de investigação, quer como protótipos para desenvolvimento de inibidores mais potentes e selectivos com fins preventivos na doença de Alzheimer.
Natural products from plants have been widely used in medicine, with several applications in an enormous variety of disorders. Among those natural products, volatile essential oils are potential candidates to enzymatic inhibition, since they have hundreds of low molecular weight and high hydrofobicity active compounds with the ability to pass trough cell membranes. In the last years, aspartic proteases are receiving considerable attention as potential drug targets since they are implicated in several serious diseases, like AIDS, Alzheimer’s disease, malaria, hypertension and some fungal infections. The dramatic raising in Alzheimer’s disease prevalence and recent findings suggesting that BACE-1 is a key enzyme for the neurodegenerative process has stimulated several groups to search for efficient inhibitors. In order to achieve this goal, the active compounds should not only be selective, but also had the ability to cross cell membranes and the blood brain barrier, what has been a difficult task. In this work, we analyzed and characterized almost fifty essential oils and started with a preliminary screening assay on recombinant proBACE-1. The results revealed some potential inhibitors, being the most promising one from Lavandula luisieri, an atypical essential oil, composed by irregular monoterpenoids with a cyclopentanic skeleton, usually called necrodane skeleton. This oil revealed an IC50 of 121,5l.ml-1 and this inhibition, as well the ability to cross over the cellular membranes, were confirmed in a cell line, giving a EC50 of 86,2g.ml-1. To elucidate which compounds are responsible for the inhibitory effect, the essential oil was analyzed in detail and fractionated. Each fraction was tested on recombinant proBACE-1 and also in BACE-1 activated by the cleavage of pro-domain with clostripain, yielding similar results, with an IC50 of 282,6g.ml-1 for the most potent fraction, named #3.1. Like the essential oil, this fraction was able to reduce, in a dose-dependent way, the production of intracellular A by CHO-APPwt cells, showing an EC50 of 94,5g.ml-1. The #3.1 fraction was mainly composed by linalool and a cyclopentanic ketone, the 2,3,4,4-tetramethyl-5-methylene-cyclopent-2-enone. Once these two compounds were obtained by organic synthesis, as well as isolated from their original fraction, the enzymatic assays revealed that 2,3,4,4-tetramethyl-5-methylene-cyclopent-2-enone was the major responsible for the inhibitory activity, while linalool had no effect at tested concentrations. At this stage any difference in potency or inhibition model between the two enzymatic forms and the purified or synthetic tetramethyl-5-methylene-cyclopent-2-enone was observed. The kinetic studies revealed a Kiapp of 415,8M, fitting the data to a competitive inhibition model. This necrodanic ketone also showed the ability to reduce the A production in two cell lines, CHO-APPwt and SHSY5Y-APPwt, the EC50 being 72,8M and 217,4M, respectively, without apparent toxicity. A reduction in sAPP levels, a fragment that directly results from BACE-1 cleavage was also observed, confirming this enzyme as one of the intracellular targets of the inhibitory compounds. Despite the enzymatic assays presented no differences between isolated and synthetic 2,3,4,4-tetramethyl-5-methylene-cyclopent-2-enone, the same was not true for cell experiments, the former being much more potent than the later. Linalool alone had no effect on cells, but trace amounts presented in the isolated ketone sample may play an important role on cellular effect as the inhibition of the synthetic ketone was modestly improved by the mixture of small amounts of linalool. In the last stage of this work we evaluated the ability of the putative inhibitors to cross the blood brain barrier and reducing A levels in vivo, in a Alzheimer’s animal model. The whole oil, its most active fraction and the tetramethyl-5-methylene-cyclopent-2-enone were tested and the results showed that all produced a perceptible lowering in brain A levels (approximately 25% for the concentrations tested), without apparent toxicity, after intranasal administration. The results presented here described new BACE-1 inhibitors, not expensive and easy to obtain, effective in cell lines and in vivo, despite its moderate specificity and potency. Therefore, they present a potential applicability on research, as well as a source of lead compounds, which inhibitory potency and selectivity could be improved by drug design. Probably, they could also be used in aromatherapy, with a preventive effect for Alzheimer’s disease.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, no ramo de Farmacognosia e Fitoquímica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/28917
Rights: openAccess
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