Desenvolvimento de metodologias de biologia molecular para a detecão de carne de cavalo (Equus caballus) em produtos cárneos

Abstract

A identificação de espécies em alimentos é cada vez mais importante para avaliar a sua autenticidade, principalmente nos produtos cárneos. O consumidor tem direito a uma escolha informada, uma vez que esta pode ser um reflexo de um estilo de vida, práticas religiosas ou problemas de saúde. Assim, uma rotulagem correta e verdadeira é fundamental para manter o consumidor informado sobre a identidade e qualidade dos produtos alimentares que está a adquirir. Recentemente, surgiu um escândalo de dimensões internacionais, relacionado com a adição de carne de cavalo não declarada em alimentos processados. Contudo, a presença desta espécie não representa um risco para a saúde do consumidor, a não ser que a carne de cavalo contenha fenilbutazona. Esta droga não é permitida para o consumo humano, uma vez que pode causar doenças sanguíneas, como a anemia aplástica. Animais que forem medicados com esta droga não podem ser utilizados para consumo, uma vez que não é possível definir um limite máximo de resíduo para este medicamento veterinário. Todavia, a presença não declarada desta espécie representa uma fraude alimentar. Assim, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de técnicas de PCR específicas e sensíveis para a identificação de carne de cavalo em produtos alimentares. Inicialmente foi desenvolvida a técnica de PCR qualitativa, onde foram estabelecidos limites de deteção (LOD) absolutos e relativos. A sensibilidade obtida para o LOD absoluto foi de 1pg e 10 pg para ADN de cavalo cruo e autoclavado, respetivamente. Relativamente ao LOD relativo também se alcançaram limites distintos para misturas binárias cruas e processadas, de 0,001% e 0,01%, respetivamente. Esta técnica foi aplicada a um conjunto de 77 amostras adquiridas antes e depois do “escândalo da carne de cavalo”, sendo que 2 revelaram a presença da espécie. Posteriormente, de forma a confirmar e quantificar a espécie de cavalo, recorreu-se à técnica de PCR em tempo real com o corante EvaGreen e análise de melting. Atingiu-se um limite de deteção absoluto de 0,1 pg de ADN de cavalo cruo e autoclavado, e um LOD relativo de 0,0001% de carne de cavalo em misturas cruas e processadas. Por fim, foi construído e validado o modelo normalizado de quantificação com base no método ΔCt, tendo-se passado à sua aplicação nas amostras que amplificaram positivamente a espécie de cavalo na PCR qualitativa. O método permitiu confirmar a presença de ADN de cavalo, no entanto os valores baixos encontrados indicaram que a presença de cavalo deverá ser resultado de contaminação cruzada e não de possível fraude. Pode-se concluir que neste trabalho foram desenvolvidas ferramentas úteis e eficazes para a deteção de adulterações em produtos cárneos com carne de cavalo.

Nowadays, identification of species in food is of major importance to evaluate food authenticity, with special emphasis on meat products. The consumer has the right of an informed choice, which may be a reflection of lifestyles, religious practices or health problems. Therefore, a correct and truthful labelling is crucial to inform the consumer about the identity and quality of food products they are buying. Recently, associated with the undeclared addition of horse meat to processed foods, an international scandal emerged. The presence of this species does not pose a health risk to the consumer, unless the horse meat contains phenylbutazone. This drug is not allowed for human consumption since it can cause blood diseases such as aplastic anaemia. Animals that are treated with this drug cannot be used for consumption since it is not possible to set a maximum residue limit for this veterinary medicine. However, the presence of non-declared horse-species is a food fraud. This work aimed at developing sensitive and specific PCR-based methods for the identification of horse meat in food products. Initially qualitative PCR assay was developed, where absolute and relative limits of detection (LOD) were established. The sensitivity obtained for the absolute LOD was 1 pg of raw horse DNA and 10 pg of processed horse DNA. The relative sensitivity was achieved by means of raw and processed binary reference mixtures, showing LOD of 0.001 % and 0.1%, respectively. This technique has been successfully applied to a set of 77 samples, prior and after the “horse meat scandal”, which showed the presence of two positive samples to horse DNA. Subsequently, in order to confirm and quantify the presence of horse, we resorted to the technique of real-time PCR with EvaGreen dye and melting curve analysis. The technique reached a absolute LOD of 0.1 pg in raw and autoclaved horse DNA and a relative LOD 0.0001% of horse meat in raw and processed mixtures. Finally, the standard model for quantification was built based on ΔCt method, successfully validated and applied to the positive samples in qualitative PCR. However, this model can be only applied in one sample. Quantification revealed the presence of the specie at very low amount, which suggests the possibility of cross-contamination. The method allowed confirming the presence of horse DNA, though the low values indicate that its presence should have been the result of cross-contamination and not an eventual food fraud. This work allowed concluding that useful and effective tools were developed for the adulteration detection in meat products with horse meat.