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Title: Unraveling cancer metabolism through flux analysis and metabolic engineering
Authors: Tavares, Ludgero Canário 
Orientador: Carvalho, Rui A.
Oliveira, Paulo J.
Keywords: Cancro; Isótopos estáveis; RMN; Metabolism; Isocitrato desidrogenase
Issue Date: 29-Jul-2015
Citation: TAVARES, Ludgero Canário - Unraveling cancer metabolism through flux analysis and metabolic engineering. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/28378
Abstract: Cancer therapies have significantly improved over the last decades. However, some cancers, such as lung cancer, still have very poor outcomes and high mortality rates, even when proper treatment is applied. New treatment strategies must be adopted, which will require better understanding of cancer mechanisms. For that purpose, three human lung cell lines were used in this study, MRC-5, a human lung fibroblast cell line and A549, H1299, two human non-small lung cancer cells. The metabolic remodeling occurring in carcinogenesis cells is firmly established. However, to understand the connection between the cellular metabolic profile and carcinogenesis, an accurate measurement of metabolic fluxes is required. In order to quantify the fluxes in these metabolic pathways, stable isotopes tracers and nuclear magnetic resonance techniques were employed. For the quantification of carbon intermediary metabolism cells were grown in 13C labelled glucose while for de novo lipogenesis (DNL) assessment 2H2O was supplemented to the culture media. To better understand and characterize cellular bioenergetics, mitochondrial membrane potential, oxygen consumption, and energy charge were also assessed. Also, recent reports describe a reductive carboxylation operated by isocitrate dehydrogenase (IDH), which may provide acetyl-coenzyme A to DNL, favoring carcinogenesis. To evaluate the impact of this reaction in the overall metabolism, IDH isoforms 1 and 2 were genetically silenced and metabolism was assessed by stable isotopes tracers. Finally, to establish a bridge between metabolic fluxes and cancer proliferation, substrate dependency studies were performed. Several metabolic inhibitors were also tested, targeting glycolysis, TCA cycle, pentose phosphate pathway (PPP) and transaminases. In this work we were able to quantify the glycolytic, TCA cycle and DNL fluxes. All cell lines exhibited heterogeneous metabolic profiles, with two distinct cancer cell lines. A549 cell line exhibited a more glycolytic phenotype while the H1299 cell line showed relatively active TCA cycle. However, both cell lines exhibited an increased DNL rate relatively to MRC-5 cell line. The overall mitochondrial bioenergetic parameters were in agreement with the metabolic profiles. The mitochondrial network was polarized and active in all cell lines, although H1299 cell line exhibited higher basal oxygen consumption and spare respiratory capacity. The reductive carboxylation operated by IDH did not contributed significantly to DNL. However, IDH silencing altered the redox homeostasis and IDH1 silencing in the A549 cell line increased the 13C enrichment of glutamine pools. Relatively to substrate dependency, all cell lines exhibited a reduced proliferation under glutamine deprivation. Finally, metabolic inhibition studies revealed an increased sensitivity in cancer cell lines to the inhibition of glucose-6-phosphate dehydrogenase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and transaminases, all reactions able to supply anabolic precursors or reducing equivalents. This work revealed that A549 and H1299 cancer cell lines exhibited different metabolic profiles even though they are both derived from non-small lung cancer. Both cancer cell lines have increased DNL but the reductive carboxylation by IDH did not contributed significantly. Nevertheless, IDH is involved in redox homeostasis and IDH1 may have a regulatory effect on glutamine pools. We were able to establish a connection between the metabolic profile and potential therapeutic targets, such as DNL or PPP.
As terapias anticancerígenas evoluíram significativamente nas últimas décadas. No entanto, os tratamentos nalguns tipos de cancros, como o do pulmão, continuam a ter baixas taxas de sucesso e elevadas taxas de mortalidade. Novas estratégias de tratamento terão de ser adotadas, as quais irão requerer uma aprofundada investigação acerca dos mecanismos do cancro. Para esse propósito, utilizámos neste estudo três linhas humanas de pulmão, MRC-5, uma linha celular de fibroblastos de pulmão e a A549 e H1299, ambas de adenocarcinoma de pulmão. A reestruturação metabólica que ocorre durante o processo carcinogénico está firmemente estabelecida. No entanto, para entender a conexão entre o perfil metabólico celular e a carcinogénese, é necessária uma quantificação precisa dos fluxos metabólicos. De forma a quantificar esses fluxos, utilizámos marcação por isótopos estáveis e técnicas de ressonância magnética nuclear. Para a quantificação e caracterização do metabolismo intermediário de carbono, as células foram cultivadas em meio de cultura contendo glucose marcada com 13C enquanto para a quantificação da lipogénese o meio de cultura foi suplementado com 2H2O. De forma a compreender melhor o metabolismo destas células, foram também avaliados parâmetros bioenergéticos, nomeadamente o potencial de membrana mitocondrial, o consumo de oxigénio e a carga energética. Descobertas recentes descrevem uma carboxilação redutiva operada pela isocitrato desidrogenase (IDH), a qual poderá abastecer acetilcoenzima A para a síntese lipídica, favorecendo o processo cancerígeno. Para avaliar o impacto desta reação no metabolismo, as isoformas 1 e 2 da IDH foram geneticamente silenciadas e o metabolismo foi analisado através de marcação por isótopos estáveis. Finalmente, para estabelecer uma ponte entre os fluxos metabólicos e a proliferação celular, realizaram-se estudos de dependência de substratos. Foram ainda utilizados vários inibidores metabólicos, dirigidos à glicólise, ciclo de Krebs, via das pentoses fosfato e transaminases. Neste estudo conseguimos quantificar os fluxos da glicólise, do ciclo de Krebs e da lipogénese. Todas as linhas celulares exibiram perfis metabólicos heterogéneos, sendo as duas linhas de cancro distintas. A linha celular A549 exibiu um fenótipo mais glicolítico enquanto a linha celular H1299 demonstrou uma atividade razoável do ciclo de Krebs. Contudo, ambas as linhas celulares de cancro exibiram uma elevada lipogénese relativamente à linha celular MRC-5. Os parâmetros bioenergéticos demostraram estar de acordo com os perfis metabólicos. A rede mitocondrial estava ativa e polarizada em todas as linhas celulares, mas no entanto, a linha H1299 exibiu um consumo basal de oxigénio e uma reserva respiratória máxima mais elevados. A carboxilação redutiva realizada pela IDH não contribuiu de forma significativa para a lipogénese. No entanto, o silenciamento da IDH causou distúrbios no redox intracelular e o silenciamento da IDH1 na linha celular A549 aumentou o enriquecimento de 13C na pool de glutamina. Relativamente à dependência de substrato, todas as linhas celulares revelaram uma redução da proliferação em condições de privação de glutamina. As linhas celulares cancerígenas exibiram uma sensibilidade aumentada relativamente à linha MRC-5, na inibição da glucose-6-fostato desidrogenase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e transaminases. Este trabalho revelou que as linhas celulares A549 e H1299 possuem diferentes perfis metabólicos apesar de serem ambas derivadas de adenocarcinoma do pulmão. As duas linhas cancerígenas possuem uma lipogénese aumentada mas a carboxilação redutiva através da IDH não contribui de forma significativa. No entanto, a IDH está envolvida no redox intracelular e a IDH1 poderá estar a exercer funções regulatórias nas pools de glutamina. Conseguimos ainda estabelecer uma relação entre o perfil metabólico e potenciais alvos terapêuticos, nomeadamente a lipogénese ou a via das pentoses fosfato.
Description: Tese de doutoramento em Biociências, especialização em Bioquímica, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/28378
Rights: openAccess
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