Please use this identifier to cite or link to this item:
https://hdl.handle.net/10316/28187
Title: | Análise do envolvimento da proteína NEP-TC na embriogénese somática do tamarilho Cyphomandra betacea | Authors: | Casimiro, Bruno Miguel Ferreira | Orientador: | Correia, Sandra Canhoto, Jorge |
Keywords: | Actividade enzimática; Calo embriogénico; Imunolocalização; RNA Metiltransferases; S-‐adenosil-‐L-‐metionina | Issue Date: | 2014 | Place of publication or event: | Coimbra | Abstract: | O
tamarilho,
Cyphomandra
betacea
(Cav.)
Sendt
é
uma
pequena
árvore
da
família
Solanaceae
que
produz
frutos
comestíveis
bastante
nutritivos,
com
um
interesse
económico
crescente.
Várias
linhas
de
investigação
têm
demonstrado
o
interesse
desta
espécie
para
a
compreensão
de
aspectos
específicos
da
morfogénese
in
vitro,
em
particular
da
indução
de
embriogénese
somática
(ES),
processo
chave
para
a
clonagem
de
plantas,
o
que
abre
portas
para
a
propagação
de
plantas
em
larga
escala.
A
indução
de
ES
em
tamarilho
consiste
num
processo
em
duas
fases
no
qual
os
calos
embriogénicos
(CE)
e
os
calos
não
embriogénicos
(CNE)
são
inicialmente
produzidos
(fase
de
indução)
num
meio
rico
em
auxina
e,
após
a
sua
transferência
para
um
meio
sem
auxina,
formam
embriões
(fase
de
desenvolvimento).
Análises
proteómicas
comparativas
de
extractos
proteicos
de
tamarilho
permitiram
identificar
uma
proteína
(NEP-‐TC,
26,5
kDa)
presente
de
forma
consistente
em
calos
não
embriogénicos,
com
um
possível
papel
inibidor
da
embriogénese
somática.
Esta
proteína
foi
associada
à
família
SpoU
de
metiltransferases
(MTase)
de
RNA
dependentes
de
SAM,
por
elevada
homologia
da
sua
sequência
com
proteínas
dessa
família
identificadas
em
Arabidopsis
thaliana.
Esta
família
de
MTases
está
anotada
como
envolvida
na
metilação
de
RNA,
especificamente
tRNA
e
rRNA,
sendo
esta
reacção
essencial
na
sua
estabilização.
Neste
trabalho,
procurou-‐se
analisar
o
envolvimento
da
NEP-‐TC
no
processo
de
embriogénese
somática,
partindo-‐se
da
optimização
dos
protocolos
de
extracção,
separação
e
caracterização
de
perfis
proteicos
de
CNE
e
CE
de
tamarilho.
Verificou-‐se
que
a
obtenção
de
um
perfil
característico
deste
material,
num
extracto
adequado
aos
ensaios
de
actividade
realizados,
foi
conseguido
com
a
utilização
do
tampão
de
extracção
Tris-‐HCl
pH
8,4
com
100mM
de
NaCl
associado
à
maceração
in
vivo
do
material.
A
caracterização
funcional
da
NEP-‐TC
como
uma
MTase
de
RNA
dependente
de
SAM
nunca
foi
até
agora
demonstrada
experimentalmente.
Procurou-‐se,
aclarar
essa
hipótese
através
de
duas
linhas
de
investigação:
(1). Realização
de
ensaios
de
actividade
enzimática
de
forma
a
avaliar
a
acção
de
metiltransferases
em
extratos
proteicos
totais
de
CE
e
CNE,
com
a
presença
da
NEP-‐TC.
(2). Estudos
imunocitoquímicos
que
permitissem
a
localização
histológica
da
NEP-‐TC.
Os
resultados
mostraram
que
em
extractos
proteicos
totais
obtidos
de
CNE
de
tamarilho,
a
actividade
específica
de
MTase
é
superior
comparativamente
a
extractos
obtidos
de
CE
de
tamarilho
e
de
CNE
de
Arabidopsis
wild
type
e
knockout
para
o
gene
da
proteína
homóloga
da
NEP-‐TC.
Conseguiu-‐se
ainda,
através
da
utilização
de
um
soro
com
anticorpo
anti-‐NEP-‐TC,
localizar
a
proteína
em
células
de
CNE
de
tamarilho,
em
particular
na
região
citosólica
em
torno
do
núcleo,
enquanto
que
em
CE
essa
detecção
não
se
verificou.
Os
dados
obtidos
enquadram-‐se
na
caracterização
proteómica
anteriormente
feita
para
perfis
proteicos
de
extractos
destes
materiais
e
na
actividade
de
MTase
desta
enzima.Estes
resultados
juntamente
com
outros
previamente
obtidos,
contribuem
com
mais
informação
para
o
estabelecimento
da
relação
entre
a
NEP-‐TC
e
as
enzimas
MTases
SpoU
bem
como
para
a
definição
da
NEP-‐TC
como
uma
proteína
chave
no
controlo
processo
de
indução
de
ES. The tamarillo, Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt, is a small solanaceous tree with a rising economic interest due to the edible fruits it produces. Several lines of research have demonstrated the usefulness of this species for understanding specific aspects of in vitro morphogenesis, in particular the induction of somatic embryogenesis (SE), a key process for plant cloning and large scale plant propagation. The induction of SE in tamarillo is of a two-‐step process in which both embryogenic callus (EC) and non-‐embryogenic callus (NEC) are initially produced in the same explant on an auxin-‐rich medium (induction stage) and later transferred to an auxin free medium in which embryo development (developmental stage) occurs. Comparative proteomic analyses of tamarillo extracts have identified a protein (NEP-‐TC, 26.5 kDa) consistently present in non-‐embryogenic callus, with a putative inhibitory role on somatic embryogenesis. This protein has been associated with SpoU SAM-‐dependent RNA MTase family, by sequence similarity with SpoU proteins identified in Arabidopsis thaliana. This SAM dependent RNA MTase family specifically methylates tRNA and rRNA, promoting their stabilization. In this study, attempts to elucidate the role of NEP-‐TC on tamarillo somatic embryogenesis were carried out., For this purpose protocols for extraction, separation and characterization of protein profiles and extracts suited for the enzymatic activity assays with tamarillo’s NEC and EC were built up. It was found that an extraction Tris-‐HCl buffer, pH 8.4, with 100 mM NaCl associated with in vivo maceration of the material gave the best results. The association of NEP-‐TC with SAM dependent RNA MTases has never been experimentally demonstrated so far. Two lines of investigation were pursued to clarify this hypothesis: (1). Activity tests to evaluate the methyltransferase activity of EC and NEC protein extracts, with NEP-‐TC. (2). Immunocytochemical studies for the localization of NEP-‐TC. The results showed that, in total protein extracts obtained from tamarillo’s NEC, the specific activity was higher than in protein extracts obtained from tamarillo’s EC and Arabidopsis wild type and knockout for NEP-‐TC SpoU homologous gene NEC. Immunolocalization assays performed with an antibody against NEP-‐TC indicated that this protein is present in tamarillo’s NEC cells, particularly in the cytosolic region around the nucleus, whereas this detection was not found in EC. These data support the results obtained through proteomic characterization of protein profiles of these calli and NEP-‐TC METase activity.These results, together with other data previously obtained in this embryogenic system, seem not only to indicate that a close relationship between NEP-‐TC and SpoU enzymes occurs but also that NEP-‐TC is a key protein controlling somatic embryogenesis. |
Description: | Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. | URI: | https://hdl.handle.net/10316/28187 | Rights: | openAccess |
Appears in Collections: | UC - Dissertações de Mestrado FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado |
Files in This Item:
File | Description | Size | Format | |
---|---|---|---|---|
DM Bruno Casimiro.pdf | 28.64 MB | Adobe PDF | View/Open |
Page view(s) 50
494
checked on Oct 15, 2024
Download(s) 50
464
checked on Oct 15, 2024
Google ScholarTM
Check
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.