Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/28106
Title: Evaluation of the expression of microRNAs in the response to therapy in Chronic Myeloid Leukemia = Avaliação da expressão de microRNAs na resposta à terapêutica na Leucemia Mieloide Crónica
Authors: Veiga, Sara Isabel Ferreira
Orientador: Ribeiro, Ana Bela Sarmento Antunes da Cruz
Moreira, João Nuno Sereno de Almeida
Keywords: Imatinib; MicroRNAs; Leucemia mieloide crónica
Issue Date: 2014
Abstract: A Leucemia Mieloide Crónica (LMC) é uma doença clonal mieloproliferativa caracterizada pela existência da translocação t(9:22), da qual resulta o cromossoma Filadélfia. Esta translocação dá origem ao gene de fusão BCR-ABL, que codifica a oncoproteina BCRABL com atividade de tirosina cinase aumentada. O Imatinib é um inibidor de tirosina cinase (TKI) que veio alterar a estratégia terapêutica habitualmente utilizada em doentes de LMC, o interferão alfa, e é atualmente o tratamento de primeira linha na doença. O Imatinib bloqueia especificamente a atividade da oncoproteina BCR-ABL e promove uma boa resposta por parte dos doentes. No entanto são conhecidos casos de resistência, sendo a razão mais comum o aparecimento de mutações no domínio BCR-ABL que impedem que o Imatinib se ligue com sucesso e exerça a sua função. Para além disto, existem outros mecanismos moleculares envolvidos na resistência a este fármaco, como a alteração da expressão dos transportadores de influxo e efluxo e das enzimas envolvidas na metabolização do fármaco, entre outros. Recentemente têm surgido várias terapias que atuam em vias de sinalização celular que se têm revelado cada vez com mais de interesse no tratamento da LMC. O Bortezomib, um inibidor do proteassoma, o Parthenolide, inibidor do NF-κB, e o Everolimos, inibidor do mTOR, são apenas alguns exemplos de novos fármacos que, devido ao seu mecanismo de ação podem revelar-se importantes no tratamento de doentes que apresentam resistência ao Imatinib. Os microRNAs são pequenas moléculas de ARN não codificante, que regulam a expressão génica ao nível pós-transcripcional. Cada vez mais se tem verificado que a alteração da expressão dos microRNAs está envolvida em várias patologias, nomeadamente no cancro. Alguns microRNAs, como o miR-21, o miR-125b e o miR-155, têm sido relacionados com a aquisição de resistência a determinadas terapias em vários tipos de neoplasias. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a influência dos níveis de expressão dos microRNAs, miR-21, miR-125b e miR-155 na sensibilidade e resistência ao Imatinib em linhas celulares de LMC, bem como no potencial efeito terapêutico de novos fármacos xii anticancerígenos dirigidos a alvos moleculares, em particular o Bortezomib, Parthenolide e Everolimus. Para atingir estes objetivos utilizámos uma linha celular modelo de LMC sensível ao Imatinib, as células K562, e uma linha celular resistente a este TKI obtida a partir da linha celular anterior, as células K562 RC. Para avaliar o efeito dos diversos fármacos na viabilidade celular recorreu-se ao ensaio metabólico da rezasurina. A morte celular foi avaliada por citometria de fluxo com a dupla marcação anexina V e iodeto de protídeo, e por microscopia óptica através da coloração May-Grünwald-Giemsa. Alguns dos mecanismos envolvidos foram analisados através dos níveis de expressão de BAX e BCL-2, dos níveis intracelulares de NF-κB, de conjugados de ubiquitina e de p53 por citometria de fluxo recorrendo à marcação com anticorpos monoclonais. Avaliou-se também por western blot os níveis de expressão e ativação da proteína AKT, na ausência e na presença dos três compostos em estudo de forma a perceber a influência destes compostos nesta via de sinalização, devido ao facto de esta via estar relacionada com os mecanismos de ação dos três microRNAs em estudo. A avaliação da expressão dos miRNAs efetuou-se por PCR em tempo real com recurso a kits comerciais. Os ensaios realizados com os fármacos em estudo revelaram que, o Bortezomib, o Parthenolide e o Everolimus, em monoterapia, induziram diminuição da viabilidade celular, de modo dependente da linha celular, da concentração, do tipo de fármaco e do tempo de incubação, induzindo morte celular preferencialmente por apoptose. Assim, nas células resistentes ao Imatinib (K562 RC) tratadas com Bortezomib e Parthenolide, observou-se um efeito citotóxico mais acentuado do que nas sensíveis, enquanto o Everolimus apresentou um efeito mais evidente nas células sensíveis K562 relativamente às células K562 RC. Por outro lado, verificamos aumento da expressão dos miR-21 e miR-125b nas células K562 RC em relação as K562. Pelo contrário, os níveis de miR-155 são inferiores nas células K562 RC em relação às K562. Estas alterações podem significar que estes miRNAs desempenham algum papel na aquisição de resistência ao Imatinib, podendo eventualmente constituir novos biomarcadores preditivos de resposta e/ou de monitorização da terapêutica com este TKI. Quando as células foram expostas a Bortezomib, Parthenolide e Everolimus, verificou-se alteração dos níveis de expressão dos microRNA nas células sensíveis e resistentes ao Imatinib. Nas células K562 verificou-se que o tratamento com os três compostos em estudo induziu um ligeiro aumento nos níveis de expressão dos miR-21 e xiii miR-155 em relação ao controlo, não se tendo observado nenhuma expressão do miR-125b. Por outro lado, nas células K562 RC, observou-se uma ligeira diminuição dos níveis de expressão do miR-21 e miR-125b, quando expostos aos três compostos em estudo. No entanto, os níveis de expressão do miR-155 apresentaram um ligeiro aumento com a exposição ao Bortezomib e ao Parthnolide e um decréscimo com a exposição ao Everolimus. Assim, o Bortezomib, Parthenolide e Everolimus poderão constituir uma nova abordagem terapêutica em doentes de LMC resistentes à terapêutica com Imatinib, podendo os níveis de expressão do miR-21, miR-125b e miR-155 ser indicadores e/ou influenciar a resposta à terapêutica.
Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal, myeloproliferative disorder characterized by the existence of the t(9:22) translocation which results in the Philadelphia Cromossome. This translocation results in the BCR-ABL fusion gene, which encodes the BCR-ABL oncoprotein with enhanced tyrosine-kinase activity. Imatinib is a tyrosine kinase inhibitor (TKI) that modified the therapeutic strategy usually used in patients with CML, the interferon alfa, and nowadays is the first line treatment in the disease. Imatinib specifically blocks the activity of the BCR-ABL oncoprotein and promotes good response by patients. However there are known cases of resistance, the most common reason being the onset of mutations in the BCR-ABL gene that prevent Imatinib to bind successfully and perform its function. Furthermore, there are other molecular mechanisms involved in resistance to this drug, as the altered expression of influx and efflux transporters and of the enzymes involved in the metabolism of the drug, among others. Recently several therapies that act in pathways that have become increasingly interesting in CML therapy, have emerged. Bortezomib, a proteasome inhibitor, Parthenolide an NF-κB inhibitor and Everolimus, an mTOR inhibitor are just a few examples of novel therapies that, due to its mechanism of action may prove to be important in the treatment of patients who present resistance to Imatinib. MicroRNAs are small noncoding RNA molecules that regulate gene expression at the post-trasncripcional level. Increasingly there has been observed that the altered expression of microRNAs is involved in several diseases, particularly in cancer. Some microRNAs, such as miR-21, miR-125b and miR-155, have been related to the acquisition of resistance to certain therapies in various types of malignancies. The aims of this study were to evaluate the influence of the expression levels of miR- 21, miR-125b and miR-155 in the response and resistance to Imatinib in CML cell lines, as well as the potencial therapeutic effect of new antineoplasic targeted drugs, particularly Bortezomib, Parthenolide and Everolimus. For this, we used a CML cell line sensitive to Imatinib, K562 cells, and a cell line resistant to this TKI, obtained from the previous, K562 RC cells. To evaluate the effect of xvi various drugs on cell viability we used the resazurin metabolic assay. Cell death was assessed by flow cytometry, with annexin V and propidium iodide double staining and by optical microscopy through staining with May-Grünwald-Giemsa. Some of the mechanisms involved were analyzed by flow cytometry, trough the expression levels of BAX and BCL-2 and the intracellular levels of NF-kB, conjugated ubiquitin and p53, using specific antibodies. AKT expression and activation levels were assessed by western blot, in the absence and presence of the three compounds in study, in order to understand the influence of these compounds in this signaling pathway, due to the fact that this pathway is related with the mechanisms of action of the three miRNAs in study. Evaluation of the expression of miRNAs was performed by real-time PCR using the commercially available kits. The assays performed with the drugs in study revealed that Bortezomib, Parthenolide and Everolimus, in monotherapy, induced decrease of cell viability, in time, dose, drug and cell line dependent manner, inducing death preferably by apoptosis. Therefore, cells resistant to Imatinib (K562 RC) treated with Bortezomib and Parthenolide presented a cytotoxic effect more pronounced than in sensitive cells, while Everolimus showed a less pronounced effect in K562 RC cells than in K562 cells. Additionally, we observed increased expression of miR-21 and miR-125b in K562 RC cells compared to K562 cells. By contrast, the levels of miR-155 decreased in K562 RC relative to K562. These changes might mean that these miRNAs play some role in the acquisition of resistance to Imatinib, and may eventually constitute new biomarkers predictive of response and / or monitoring of therapy with this TKI. Upon exposure to Bortezomib, Parthenolide and Everolimus it was observed an alteration in the expression levels of the microRNAs in Imatinib-sensitive and resistant cells. In K562 cells it was noted that treatment with the three compounds in study induced a slightly increase in the expression levels of miR-21 and miR-155, when compared to control, not having been noted any expression of miR-125b. Moreover, in K562 RC cells, it was observed a slightly decrease in the expression levels of miR-21 and miR-125b, when exposed to the three compounds in study. However, miR-155 expression levels presented a slightly increase upon exposure to Bortezomib and Parthenolide, and a decrease with Everolimus exposure. Thus, Bortezomib, Parthenolide and Everolimus may constitute a novel therapeutic approach to CML patients resistant to treatment with Imatinib, and the expression levels of miR-21, miR-125b and miR-155 may be indicators and/or influence the therapeutic response
Description: Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/28106
Rights: openAccess
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UC - Dissertações de Mestrado

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