Brain endothelial cells protection by pinacidil preconditioning in an okadaic acid-induced Alzheimer’s disease model: role of mitoKATP channels, ROS and HIF-1α

Abstract

A doença de Alzheimer, a doença neurodegenerativa mais comum no idoso, é caracterizada por uma deterioração progressiva da memória e função cognitiva, e neurodegenerescência severa associada à ocorrência de duas características patológicas distintas: a deposição extracelular do peptídeo β-amiloide no parênquima cerebral e vasos sanguíneos cerebrais e acumulação intracelular de tranças neurofibrilares compostas por proteína tau hiperfosforilada. Actualmente, não existe nem cura nem tratamento eficaz para a doença de Alzheimer. Entre as estratégias de protecção existentes, o pré-condicionamento surge como um fenómeno que confere tolerância cerebral contra possíveis insultos letais através da activação de uma resposta endógena adaptativa e de sobrevivência. Embora os mecanismos moleculares específicos associados ao pré-condicionamento permaneçam desconhecidos, o factor de transcrição induzido por hipóxia 1α e as mitocôndrias são reconhecidos como peças integrantes do puzzle do pré-condicionamento. Especificamente, as espécies reactivas de oxigénio produzidas pelas mitocôndrias bem como os canais de potássio mitocondriais sensíveis ao ATP foram identificados como intermediários e alvos mitocondriais específicos envolvidos no fenómeno do pré-condicionamento. Desta forma, este estudo foi realizado para decifrar o papel das espécies reactivas de oxigénio produzidas pela mitocôndria e da via de sinalização mediada pelo factor de transcrição induzido por hipóxia 1α na proteção desencadeada pelo pré-condicionamento com pinacidil, um modulador dos canais de potássio mitocondriais sensíveis ao ATP, num modelo in vitro da doença de Alzheimer induzido pelo ácido ocadaico que promove a hiperfosforilação da proteína tau, através da inibição das fosfatases 1 e 2A. Usando as células RBE4, uma linha de células endoteliais de cérebro de rato, observou-se que concentrações sub-letais de pinacidil (≤ 10 μM, durante 24 horas) aumentaram significativamente a produção de superóxido. Recorrendo a microscopia confocal verificou-se que o pinacidil altera a rede mitocondrial nas células endoteliais, promovendo uma distribuição perinuclear de mitocôndrias alongadas. Constatou-se ainda que o pinacidil também aumenta os níveis proteicos do transportador de glucose-1 e do factor de crescimento do endotélio vascular, dois genes alvo específicos do factor de transcrição induzido por hipóxia 1α. Notavelmente, o pré-condicionamento com pinacidil impediu a perda de viabilidade celular e o potencial de membrana mitocondrial, e a produção excessiva de superóxido promovida pelo ácido ocadaico. Contudo, os efeitos protectores do pré-condicionamento com pinacidil foram inibidos na presença do antagonista específico dos canais de potássio mitocondriais sensíveis ao ATP, o ácido 5-hidroxidecanóico, do antioxidante mitocondrial coenzimaQ10, e do inibidor do factor de transcrição induzido por hipóxia 1α, o 2-metoxiestradiol. Por último, o pré-condicionamento com pinacidil preveniu parcialmente o efeito do ácido ocadaico na morfologia (mitocôndrias pequenas e arredondadas) e distribuição espacial (zona perinulear) das mitocôndrias. 7 Em conjunto, estes resultados mostram que a produção de espécies reactivas de oxigénio mediada por activadores dos canais de potássio mitocondriais sensíveis ao ATP e a indução do factor de transcrição induzido por hipóxia 1α são eventos cruciais no fenómeno do pré-condicionamento, sugerindo que os canais de potássio mitocondriais sensíveis ao ATP podem representar possíveis alvos terapêuticos na doença de Alzheimer.

Alzheimer’s disease, the most prevalent age-related neurodegenerative disease, is characterized by a progressive deterioration in memory and cognitive function and severe neurodegeneration associated with the occurrence of two distinctive pathological hallmarks: the extracellular deposition of amyloid-β in brain parenchyma and cerebral blood vessels and the presence of intracellular neurofibrillary tangles containing hyperphosphorylated tau protein. Currently, there is still no cure or effective therapy for Alzheimer’s disease. Among the existing protective strategies, preconditioning emerges as a phenomenon that triggers brain tolerance against potential lethal insults by activating endogenous adaptive and pro-survival events. Although the exact molecular mechanisms underlying preconditioning remain unclear, the transcription factor hypoxia-inducible factor-1α and mitochondria have been proposed to be critical pieces of the preconditioning puzzle. Particularly, mitochondrial-derived reactive oxygen species and mitochondrial ATP-sensitive potassium channels were identified as specific mitochondrial mediators and targets in the preconditioning phenomenon. Within this scenario, this study was undertaken to decipher the role of mitochondrial-derived reactive oxygen species and hypoxia-inducible factor-1α signaling pathway in the protection triggered by pinacidil preconditioning, a mitochondrial ATP-sensitive potassium channel modulator, in an in vitro model of Alzheimer’s disease induced by okadaic acid that promotes tau hyperphosphorylation by inhibiting protein phosphatases 1/2A. Using the rat brain endothelial cell line RBE4, it was observed that non-toxic concentrations of pinacidil (≤ 10μM; 24 hours) significantly increased superoxide anion production. Confocal microscopy analysis revealed that pinacidil affects mitochondrial network by promoting a perinuclear distribution of elongated mitochondria. Pinacidil also increased the protein levels of glucose transporter-1 and vascular endothelial growth factor, two specific downstream target genes of hypoxia-inducible factor-1α. Importantly, pinacidil preconditioning prevented the loss of cell viability and mitochondrial membrane potential, and superoxide anion overproduction promoted by okadaic acid. However, the protective effects mediated by pinacidil preconditioning were abolished by the specific mitochondrial ATP-sensitive potassium channel antagonist 5-hydroxydecanoic acid, the mitochondrial reactive oxygen species scavenger coenzyme Q10, and the hypoxia-inducible factor-1α inhibitor 2-metoxyestradiol. Finally, pinacidil preconditioning partially attenuated the effect of okadaic acid on mitochondrial shape (smaller and round mitochondria) and spatial distribution (perinulear area). Overall, these results show that mitochondrial ATP-sensitive potassium channels activators-mediated reactive oxygen species production and induction of hypoxia-inducible factor-1α are critical mechanistic “steps” involved in the preconditioning phenomenon and suggest that mitochondrial ATP-sensitive potassium channels may represent possible therapeutic targets for Alzheimer’s disease.