Estudo da biotividade de óleos essenciais de tomilhos de Portugal

Abstract

O género Thymus L. compreende espécies aromáticas de grande relevo etnobotânico e industrial, essencialmente devido aos seus óleos essenciais que possuem múltiplas utilizações na medicina tradicional dos povos do Mediterrâneo e aplicações nas indústrias de perfumes, cosméticos, produtos farmacêuticos e agro-alimentares. Embora este género se encontre muito bem representado em Portugal, poucos estudos se têm direcionado para a avaliação do potencial bioativo de tomilhos endémicos, visando a validação científica das suas propriedades e determinação do seu perfil de segurança. Neste contexto, tendo como objeto de estudo os óleos essenciais de duas espécies de tomilhos, Thymus albicans Hoffm. & Link, um endemismo ibérico, e Thymus lotocephalus G. Lopèz & R. Morales, um endemismo lusitânico, determinaramse, com recurso a modelos in vitro, a atividade antifúngica, anti-inflamatória, e respetivos mecanismos de ação, bem como a citotoxicidade em diferentes linhas celulares de mamíferos, visando a sua aplicação eficaz e segura como agentes terapêuticos alternativos e/ou complementares. O potencial antifúngico dos óleos essenciais e dos seus compostos maioritários isolados (1,8-cineol, α-terpineol, borneol e óxido de cariofileno) foi avaliado através da determinação da concentração mínima inibitória (MIC) e da concentração mínima letal (MLC). Adicionalmente, o efeito dos óleos essenciais na inibição do tubo germinativo e na atividade de enzimas mitocondriais (viabilidade celular) foi também determinado para Candida albicans ATCC 10231. Os óleos essenciais em estudo demonstraram ter, de um modo geral, melhor atividade do que os seus compostos maioritários isolados, com eficácia contra estirpes de Candida, Cryptococcus neoformans, dermatófitos e Aspergillus, tendo sido mais ativos contra as estirpes de dermatófitos, com valores de MIC e MLC entre 0,16 e 1,25 μL mL-1. Demonstraram, também, capacidade de inibir a formação do tubo germinativo a concentrações sub-inibitórias e de comprometer a função mitocondrial de forma dose-dependente. A atividade anti-inflamatória dos óleos essenciais foi determinada usando o modelo in vitro de macrófagos de ratinho (Raw 264,7) estimulados por LPS, pela avaliação da sua capacidade de inibir a produção de óxido nítrico (NO), um mediador chave do processo inflamatório. De forma a elucidar o mecanismo de ação, foi também avaliado o potencial “scavenger” e o efeito do óleo mais ativo na expressão de enzimas chave, nomeadamente a forma induzível da sintase do NO (iNOS) e da ciclo-oxigenase(COX-2). Os resultados obtidos revelam atividade anti-inflamatória do óleo essencial de T. albicans pela inibição da produção de NO e da expressão de iNOS (0,64 μL mL-1). Tendo em consideração o potencial bioativo do óleo essencial de T. albicans para futuras aplicações terapêuticas em humanos e animais, foi determinado o seu perfil de segurança através de ensaios de citotoxicidade (viablidade celular) em macrófagos (Raw, 264,7), queratinócitos (HaCat) e hepatócitos (HepG2). O óleo essencial não revelou toxicidade para as linhas celulares estudadas a concentrações em que: é fungicida para dermatófitos (0,16 μL mL-1); é capaz de inibir a formação do tubo germinativo (0,16 e 0,32 μL mL-1), um importante fator de virulência cuja inibição é relevante para o tratamento de candidíases invasivas, e para as quais apresenta atividade anti-inflamatória (0,32 e 0,64 μL mL-1). Assim, o rendimento do óleo essencial de T. albicans, o seu potencial antifúngico e anti-inflamatório, bem como o amplo perfil de segurança demonstrados, garantem o interesse industrial para futura comercialização. Nesse sentido, ensaios futuros visando o desenvolvimento de um cosmecêutico ou nutracêutico para complemento terapêutico em infeções fúngicas e doenças de cariz inflamatório, são justificados. Adicionalmente, estabeleceu-se e otimizou-se um protocolo de avaliação da fitotoxicidade de um composto maioritário nestes óleos, o 1,8-cineol, numa linha celular de medula de tabaco (Nicotiana tabacum L.), BY-2, que permitirá, entre outras aplicações possíveis, avaliar o potencial herbicida dos óleos, visando o desenvolvimento futuro de um bioherbicida de origem terpénica, de forma a minimizar a contaminação ambiental e o surgimento de ervas daninhas resistentes, resultante do uso de herbicidas sintéticos.

The genus Thymus L. comprises aromatic plants of great ethnobotanical and industrial relevance, mainly due to its essential oils highly valued in traditional medicine, primarily in the Mediterranean region and in several industries including perfumery, cosmetic, pharmaceutical, agricultural, food and beverages. Although thyme species are very common in Portugal, studies on the bioactive potential and safety profile of endemic plants remain sparse. Therefore, the present study aims the valorization of Thymus albicans Hoffm. & Link, an Iberian endemism, and Thymus lotocephalus G. López & R. Morales, a portuguese endemism, by validating the antifungal and anti-inflammatory activities, and related mechanisms of action of their essential oils and pointing out their safety profile in different mammalian cell lines, for future application as effective and safe alternative and/or complementary therapeutic agents. The antifungal potential of the oils and their major compounds (1,8-cineole, α- terpineol, borneol and caryophyllene oxide) was assessed by evaluating the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal lethal concentration (MLC). Additionally, the effect of essential oils in both the germ tube inhibition and mitochondrial enzymes activity (cell viability) was also determined for Candida albicans ATCC 10231. In general, the essential oils were more effective than the isolated major compounds, against strains of Candida, Cryptococcus neoformans, dermatophytes and Aspergillus, being more active against dermatophytes, with MIC and MLC values varying between 0.16 and 1.25 μL mL-1. Moreover, their ability to inhibit the formation of germ tubes at sub-inhibitory concentrations and to impair mitochondrial function in a dose-dependent manner were also pointed out. The anti-inflammatory activity of essential oils was assessed using an in vitro model of murine macrophages (Raw 264.7) stimulated with LPS, through their ability to inhibit the production of nitric oxide (NO), a key mediator of inflammation. In order to elucidate mechanisms of actions underlying this effect, the oil’s scavenging activity as well as the effect of the most active oil on the expression of key enzymes, including inducible NO synthase (iNOS) and cyclooxygenase (COX-2) were also evaluated. The results confirm the anti-inflammatory potential of T. albicans essential oil through inhibition of NO production and a selective inhibition of iNOS expression (0.64 μL mL- 1).Taking into account the bioactive potential of T. albicans essential oil for future therapeutic applications in humans and animals, its safety profile was disclosed. Cytotoxicity assays (cell viability) were carried out in macrophages (Raw 264.7), keratinocytes (HaCat) and hepatocytes (HepG2). The essential oil was devoid of toxicity at concentrations for which it showed: fungicidal activity against dermatophytes (0.16 μL mL-1); inhibited germ tube formation (0.16-and 0.32 μL mL-1), an important virulence factor whose inhibition is relevant for the treatment of invasive candidiasis, and for which it revelaed anti-inflammatory activity (0 32 μL mL-1 and 0.64 ml -1). Thus, the yield of T. albicans essential oil, its antifungal and anti-inflammatory potential, as well as its broad safety profile, supports its industrial relevance and future comercialization. Thereby, future assays should be considered for development of a cosmeceutical or nutraceutical as therapeutic complements in fungal infections and inflammatory-related diseases. Furthermore, a protocol for assessing the phytotoxicity of the essential oil’s major compound, 1,8-cineole, was established and optimized, using a tobacco (Nicotiana tabacum L.) cell line BY-2. Among other possible applications, this protocol allows the evaluation of esssential oils herbicidal potencial, aiming the further development of a terpene-based bioherbicide, in order to minimize the environmental contamination and the emergence of resistant weeds, related to the extensive use of synthetic herbicides.