Generation of a VASA/GDF-9/ZP3-promoter driven triple transgenic reporter mouse line as a tool to study ovarian dynamics

Abstract

Neste estudo foi criada, caracterizada uma nova linha de ratinhos transgénicos, posteriormente usada como ferramenta para explicar o papel da anatomia do ovário no estabelecimento da primeira onda de activação folicular. Neste ratinho, promotores exclusivamente expressos no oócito (Vasa, Gdf9 e Zp3) foram usados para controlar a expressão de três proteínas fluorescentes (EGFP, mCherry e AmCyan, respectivamente), criando uma linha reporter que permite seguir de forma dinâmica a activação e crescimento foliculares. Para criar a linha transgénica, três construções de DNA independentes foram co-injectadas em embriões de ratinho. A linha 5570 foi selecionada para estudo pormenorizado, revelando uma expressão de proteínas fluorescentes dependente da classe folicular e apresentando também heterogeneidade dentro da mesma classe folicular, sugerindo uma estratificação de actividade não previamente descrita. A expressão de proteínas fluorescentes revelou também que os primeiros folículos a serem activados encontram-se restritos à região anterior-dorsal do ovário, levando a explorar a relação anatómica entre meiose, formação e activação folicular. Foram observadas diferenças dorso-ventrais, com células germinais na região ventral do ovário a entrar mais cedo em meiose. Em contraste, os primeiros folículos formados aparecem na região dorsal do ovário. Foi também observado que diferenças geográficas no momento de formação de folículos resultam em capacidades distintas para iniciar crescimento folicular, como revelado por diferenças na expressão de proteínas fluorescentes nas regiões dorsais e ventrais do ovário, mantidas durante todo o período pré-pubertal. Em resumo, este estudo sugere que a especificação do ovário em córtex e medula influencia a localização da primeira onda de activação folicular, permitindo um desenvolvimento distinto em zonas diferentes do ovário o que determina uma hierarquia de recrutamento de folículos primordiais.

In this study a triple transgenic mouse line was generated, characterized and used as a tool to explain the role of ovarian anatomy in the establishment of the first wave of follicle activation. In this mouse, oocyte-specific promoters (VASA, GDF-9 and ZP3), active at distinct stages of oocyte and follicle development, were used to drive the expression of exogenous fluorescent proteins (EGFP, mCherry and AmCyan, respectively), creating a reporter line to dynamically follow follicle activation and growth. The mice were generated by co-injection of three independent DNA constructs, resulting in nine independent transgenic founder lines. Line 5570 was then selected for further study, revealing a follicle-class dependent expression of fluorescent protein. Interestingly, the fluorescent profile of the oocytes differed even within follicle classes, suggesting an underlying activity or intrinsic stratification of function not previously appreciated. In addition, the expression of fluorescent protein revealed that the first growing follicles were restricted to the anterior-dorsal ovarian region, which led an exploration of the anatomical relationship between meiosis, follicle formation and activation. Dorsal-ventral differences in the onset of meiosis were observed, with an early entry in the ventral region. In contrast, the first germ cells encapsulated into were present in the dorsal region. Furthermore, the geographic differences in the timing of follicle formation resulted in distinct ability to initiate growth, as revealed by different fluorescent profiles in dorsal and ventral regions maintained throughout the prepubertal period. Altogether, this study suggested that the specification of cortical and medullar regions impacts where the first follicular activation occurs, with an asynchronous germ cell development in different regions of the ovary determining the order of primordial follicle recruitment.