Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/27079
Title: Following Amphiphilic Molecules on Their Way through Lipid Membranes: Development of a Kinetic Model of Passive Permeation through the Blood-Brain Barrier
Authors: Filipe, Hugo 
Orientador: Silvestre, Maria
Loura, Luís
Keywords: Molecular dynamics simulations; Potential of mean force; Cholesterol homeostasis; Permeability
Issue Date: 12-Dec-2014
Citation: FILIPE, Hugo Alexandre Louro - Following amphiphilic molecules on their way through lipid membranes : development of a kinetic model of passive permeation through the blood-brain barrier. Coimbra : [s.n.], 2014. Tese de doutoramento. Disponível na WWW em:<http://hdl.handle.net/10316/27079>.
Abstract: O transporte passivo é a principal via para a permeação de fármacos e xenobióticos através de monocamadas de células, como as que constituem o endotélio da barreira hemato-encefálica. A caracterização da velocidade de permeação passiva de um dado fármaco através de bicamadas lipídicas é, por conseguinte, um passo muito importante na previsão da sua farmacocinética. Neste trabalho realizámos um estudo detalhado, em escalas espaciais e temporais diversas, da permeação de moléculas anfifílicas através de membranas lipídicas, e sua distribuição entre diversos compartimentos biológicos. Neste sentido foram realizadas e analisadas simulações de dinâmica molecular com o detalhe atómico dos sistemas, e também simulações com modelos cinéticos usando dados experimentais e informações ao nível macroscópico dos sistemas biológicos. Na sequência do trabalho desenvolvido nos últimos anos por este grupo de investigação, caracterizou-se com detalhe atómico a interação da série homóloga de aminas gordas, NBD-Cn, com bicamadas lipídicas de diferentes composições. As composições lipídicas escolhidas foram POPC, o principal constituinte das membranas biológicas eucarióticas e, POPC:Chol (1:1) e SpM:Chol (6:4), que permitem a representação dos folhetos interno e externo, respectivamente, dos eritrócitos e da membrana plasmática de células endoteliais. A série homóloga escolhida permite o estudo sistemático dos efeitos da estrutura molecular, neste caso, o número de átomos de carbono da cadeia apolar das anfifilas, em várias propriedades da interacção com as bicamadas lipídicas e na permeação através de monocamadas de células. A descrição atomística destes sistemas através de simulações de dinâmica molecular tem dado uma contribuição considerável para a interpretação dos resultados experimentais obtidos pelo grupo de investigação. Em bicamadas de POPC, e para todas as anfifilas, o grupo NBD localiza-se próximo do grupo glicerol do lípido. Em bicamadas de POPC:Chol (1:1) e SpM:Chol (6:4), o grupo NBD localiza-se na interface, numa posição mais externa do que nas bicamadas de POPC puro. Além disso, a técnica de “umbrella sampling” foi aplicada com o objectivo de obter e comparar barreiras de energia livre calculadas com barreiras de energia livre determinadas experimentalmente para os processos de inserção/dessorção e translocação das anfifilas em bicamadas lipídicas. Alguns problemas presentes em cálculos de energia livre em bicamadas lipídicas foram identificados. Verificámos que a região mais problemática para os cálculos de energia livre, com moléculas anfifílicas de cadeia longa é a interface membrana-água. Para todas as bicamadas estudadas, os perfis de Potential of Mean Force (PMF) têm um valor mínimo quando NBD está localizado na região das cabeças dos lípidos, numa posição mais externa em membranas contendo colesterol, de acordo com outras simulações e resultados experimentais. A comparação quantitativa entre os dados revelou-se muito complicada, impedindo a determinação de constantes de velocidade destes processos para sistemas que não tenham sido experimentalmente caracterizados. No entanto, a descrição qualitativa da interação das anfifilas em diferentes profundidades da bicamada foi realizada. Esta informação fornece uma ilustração esclarecedora do caminho de moléculas anfifilas durante o processo de permeação através de membranas lipídicas. Numa maior escala temporal e espacial, a homeostase e distribuição de colesterol no sangue foram modeladas usando dados experimentais para a interação do desidroergosterol (DHE) e do colesterol com os principais compartimentos do sangue, ou seja, bicamadas lipídicas que imitam a membrana do eritrócito, lipoproteínas e albumina. O DHE parece ser um bom análogo do colesterol em relação à sua distribuição de equilíbrio. No entanto, a sua cinética de interacção com compartimentos biológicos é significativamente mais rápida. Os resultados mostram a importância da via passiva na homeostase do colesterol no sangue. Além disso, os resultados mostram que a aplicação de dados experimentais para a interacção de moléculas anfifílicas com compartimentos biológicos podem ser usados para avaliar a sua permeação passiva através de barreiras biológicas. Esta metodologia foi aplicada para construir um modelo cinético capaz de simular a permeação passiva de moléculas anfifílicas, como fármacos, através de uma monocamada de células, análoga ao endotélio da barreira hemato-encefálica. Este estudo permitiu a obtenção de regras para a permeação de drogas através da barreira hemato-encefálica. Para alguns derivados da série homóloga NBD Cn, um aumento na hidrofobicidade leva a uma diminuição na velocidade de acumulação nos tecidos, em oposição ao previsto pelo modelo de partição-difusão. Verificou-se que o passo limitante da velocidade para a permeação através do endotélio depende das características moleculares das anfifilas. Para cadeias longas, é a interacção (constante da velocidade de dessorção) com a membrana do endotélio, enquanto que para cadeias curtas é translocação entre monocamadas. Para comprimentos de cadeia intermédios nenhum passo limitante da velocidade pode ser definido. Verificou-se igualmente que a sequestração do soluto por agentes no compartimento dador reduz substancialmente a velocidade de permeação.
Passive transport is the major route for the permeation of drugs and xenobiotics through tight cell monolayers such as the tight endothelia of the blood-brain barrier (BBB). The characterization of the rate of passive permeation through lipid bilayers for a given drug is therefore a critical step in the prediction of its pharmacokinetics. In this work we have performed a detailed study, at different time and length scales, of the permeation of amphiphiles through lipid membranes, and their distribution among biologic compartments. In this regard, we performed and analyzed detailed atomistic Molecular Dynamics (MD) simulations, and also kinetic modeling simulations comprising experimental data and macroscopic information of biological systems. Following the work developed in the last years by this research group, we characterized at atomic detail the interaction of the homologous series of fatty amines, NBD-Cn, with lipid bilayers of different compositions. The chosen lipid compositions are POPC, the major constituent of eukaryotic biomembranes, and POPC:Chol (1:1) and SpM:Chol (6:4), which mimic the inner and outer leaflets, respectively, of erythrocytes and plasma membrane of endothelial cells. The chosen homologous series allows the systematic study of the effect of molecular structure, namely the number of carbons of the alkyl chain of the amphiphiles, on several properties regarding the interaction with lipid bilayers, and the permeation through cell monolayers. The atomistic description of these systems using unrestrained MD simulations has been a considerable contribution for the interpretation of experimental results obtained by the research group. In POPC bilayers, the NBD fluorophore locates near the glycerol backbone/carbonyl region of the lipid, for all amphiphiles. In POPC:Chol (1:1) and SpM:Chol (6:4) bilayers, the NBD group locates at the interface, in a more external position than observed in pure POPC bilayers. Further, the umbrella sampling technique was applied in order to compare calculated and experimental free energies for the insertion/desorption and translocation steps of the amphiphiles’ interaction with lipid bilayers. Some pitfalls in free energy calculations were identified. We found that the most challenging environment for free energy computations with long amphiphiles is the membrane-water interface. For all studied bilayers the Potential of Mean Force (PMF) profiles have a minimum value when NBD is located at the head group region, which is more external in cholesterol containing bilayers in agreement with other simulations and experimental results. A quantitative comparison between calculated and experimental data proved very complicated, precluding the determination of rate constants for systems that were not experimentally characterized. However, the qualitative description of the interaction of the amphiphiles with the lipids, at different bilayer depths was performed. This gives an enlightened illustration of the path of the amphiphiles during the permeation process through lipid membranes. At larger time and length scales the blood homeostasis and distribution of cholesterol were modeled using experimental data for the interaction of dehydroergosterol (DHE) and cholesterol with major blood compartments, namely lipid bilayers mimicking the erythrocyte membrane, lipoproteins, and albumin. DHE seems to be an adequate surrogate of cholesterol concerning its equilibrium distribution. However, its kinetics of interaction with biological compartments is significantly faster. The results show the importance of the passive pathway in free cholesterol homeostasis in the blood. Further, the results show that the application of experimental data for the interaction of amphiphilic molecules with biologic compartments can be used to assess their passive permeation through biological barriers. This methodology was applied to build a kinetic model for the passive permeation of amphiphilic molecules, like drugs, through a cell monolayer such as the tight endothelium of the BBB. This allowed the obtention of rules for the BBB permeation of drugs. For some derivatives of the NBD-Cn homologous series, an increase in hydrophobicity leads to a decrease in the characteristic rate of accumulation in the tissue, in opposition to that predicted by the solubility-diffusion model. The rate limiting step for overall permeation through the endothelium was found to depend upon molecular characteristics of the amphiphile. For long chains it is the interaction (desorption rate constant) with the membrane of the endothelium, whereas for short chains it is translocation between bilayer leaflets. For intermediate chain lengths no single rate-limiting step can be defined. It was also found that solute sequestration by binding agents in the donor compartment substantially reduces the rate of overall permeation.
Description: Tese de doutoramento em Química, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/27079
Rights: openAccess
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