Title: Virulence factors associated with antimicrobial resistance determinants among Escherichia coli and Klebsiella spp
Authors: Calhau, Vera Mónica Tavares Vinhas 
Orientador: Silva, Gabriela da
Mendonça, Nuno
Keywords: Klebsiella spp.;Escherichia coli;Virulence;Resistance;Pathogenicity Islands
Issue Date: 23-Apr-2015
Citation: CALHAU, Vera Mónica Tavares Vinhas - Virulence factors associated with antimicrobial resistance determinants among escherichia coli and klebsiella spp. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/27036
Abstract: Escherichia coli and Klebsiella spp. are important pathogens, responsible for several infectious diseases. These members of Enterobacteriaceae family are of particularly concerning due to a high increase in their resistance to antimicrobials. The detection of more resistant strains brings into question if this enhancement of resistance may be accompanied by an increase in virulence. If so, extremely pathogenic strains would start to emerge, and no antibiotic therapy would be available to fight them, leading to serious public health problems. Thus, the main objective of this research was to understand the relation between virulence and resistance among E. coli collected from different origins and Klebsiella spp.. The interplay between resistance and virulence was studied among Uropathogenic E. coli (UPEC). E. coli strains are classified into four main phylogenetic groups. More virulent strains belong mainly to phylogroup B2 and, to a lesser extent, to group D, and most of the commensal strains belong to groups A and B1. During the characterization of strains, a new genotype was discovered in the Clermont method, which is used to assess phylogenetic groups. This yjaA/ tspE4.C2 genotype was assigned to phylogroup B2. Pathogenicity islands (PAIs) are mobile genetic elements that carry virulence genes and may increase the virulence of bacteria. PAI I536, PAI II536, PAI III536 and PAI IIJ96 were found to be associated to phylogroup B2. A trade-off between virulence and resistance was observed for these islands, as they were generally found among susceptible strains. The same was observed for the majority of individual virulence genes including adhesins, toxins and siderophore systems. Contrarily, a correlation was observed for the PAI IV536, PAI ICFT073 and PAI IICFT073 and resistance to amoxicillin-clavulanic acid, cephalothin, cefotaxime, ceftazidime and gentamicin. This combination of PAIs, along with IncF plasmid, blaCTX-M-15 and aac(6’)-lb-cr genes, was also found to be prevalent among the UPEC CTX-M-15 producers assigned to the sequence type ST131. It was observed that strains with a higher number of identified plasmids carried less PAIs. It was hypothesised that the biological cost of the carriage of a resistance plasmid was higher to the cell, according to the number of PAIs carried. Conjugation assays and fitness studies were performed, and the latter indicated that the carriage of a higher number of PAIs did not implicate a direct rise in the fitness cost of the acquisition of the resistance plasmid, at least in strains harbouring until three PAIs. Participation on an international study with E. coli isolates from Nigeria, allowed comparing the characteristics of these isolates with the Portuguese ones. Even though regional differences were observed, clone ST131, IncF plasmids and blaCTX-M-15 were common in the two countries. This supports the fact that clone ST131 and the referred resistance determinant are widely and successfully disseminated worldwide. The same E. coli ST131 clone, carrying resistance determinants blaCTX-M-15, blaTEM-type, qnrS and aac(6’)-lb-cr; IncF and IncP plasmids, and virulence factors PAI IV536, PAI ICFT073, PAI IICFT073, iutA, sfa/foc and papAH, was also identified at the effluent of a hospital wastewater treatment plant (WWTP). This shows that WWTPs may be contributing to the dissemination of virulent and resistant bacteria into water ecosystems, constituting, thus, an environmental and public health risk. The interplay between resistance and virulence was also assessed for K. pneumoniae and K. oxytoca. PAI IV536 was statistically associated to resistance to gentamicin and sulfamethoxazole-trimethoprim among K. pneumoniae. The presence of PAI IICFT073 was firstly identified among K. oxytoca in this study. It was significantly associated with resistance to cephalothin, cefotaxime, ceftazidime, ciprofloxacin, and gentamicin. Contrarily to the observed in E. coli, the trade-off between resistance and virulence did not seem to exist. In fact, among K. pneumoniae, higher prevalence of virulence factors was detected among isolates resistant to ciprofloxacin and gentamicin and at a lesser extent to cefotaxime and sulfamethoxazole- trimethoprim. Furthermore, higher prevalence of virulence genes was observed in K. oxytoca resistant to sulfamethoxazole-trimethoprim. Multidrug resistant K. pneumoniae isolates from an outbreak in a renal transplant unit were studied and characterized for virulence factors, resistance determinants and genetic relatedness. Two main genetic lineages were detected excluding the hypothesis of an outbreak caused by a single internal clone. PAI III536 and PAI IICFT073 were detected for the first time in K. pneumoniae during this study. Overall, the results presented in this dissertation indicated that, although it was detected a general trade-off between resistance and virulence among E. coli, the same was not usually verified for Klebsiella spp. isolates. Nonetheless, despite of the trade-off verified in E. coli, clone ST131, found among Portuguese and Nigerian isolates in this study, is an example that in this species, virulence and resistance features may co-exist. The interplay between resistance and virulence seems to be, therefore, influenced by the genus and species, the virulence factor, and the resistance phenotype and genotype.
Escherichia coli e Klebsiella spp. são importantes agentes patogénicos, responsáveis por diversas doenças infecciosas. Estas bactérias da familia Enterobacteriaceae são particularmente preocupantes, devido ao crescente aumento da sua resistência aos antimicrobianos. A detecção de estirpes mais resistentes leva a ponderar sobre um eventual aumento simultâneo da virulência. Caso isto se verifique, a emergência de estirpes extremamente patogénicas, para as quais não haverá alternativas terapêuticas, levaria a sérios problemas de Saúde Pública. Desta forma, o principal objectivo desta investigação foi compreender a relação entre virulência e resistência em E. coli de diferentes origens e em isolados do género Klebsiella. A relação entre resistência e virulência foi estudada em E. coli uropatogénicas. As estirpes de E. coli podem ser classificadas em quatro grupos filogenéticos principais. As estirpes mais virulentas pertencem maioritariamente ao grupo B2, seguido do D, enquanto que a maioria das comensais pertencem aos grupos A e B1. Durante a caracterização das estirpes, foi descoberto um novo genótipo usando o método de Clermont, utilizado para identificar os filogrupos. Este genótipo yjaA/ tscpE4.C2 foi atribuído ao grupo filogenético B2. As ilhas de patogenicidade (PAIs) são elementos genéticos móveis que transportam genes de virulência e, consequentemente, aumentam a virulência bacteriana. Neste trabalho, as ilhas PAI I536, PAI II536, PAI III536 e PAI IIJ96 foram associadas ao filogrupo B2. Relativamente a estas ilhas, observou-se uma relação inversa entre resistência e virulência, uma vez que foram geralmente encontradas em estirpes susceptíveis. O mesmo foi observado para a maioria dos genes individuais de virulência, nomeadamente de adesinas, toxinas e sideróforos. Contrariamente, observou-se uma correlação entre a PAI IV536, PAI ICFT073 e PAI IICFT073 e as resistências à amoxicilina-ácido clavulânico, cefalotina, cefotaxima, ceftazidima e gentamicina. Esta combinação de PAIs juntamente com um plasmídeo IncF, e os genes blaCTX-M-15 e aac(6’)-lb-cr, foram também mais prevalentes nos isolados de E. coli uropatogénicas produtoras de CTX-M-15, identificadas como pertencendo ao clone ST131. Observou-se que as estirpes com maior número de plasmídeos identificados tinham menor número de PAIs. Colocou-se então a hipótese de que a presença de um plasmídeo de resistência e um maior número de PAIs levaria a um custo biológico para a célula. Assim, efectuaram-se ensaios de conjugação e estudos de fitness, tendo sido concluído que a presença de maior número de ilhas não implicava um aumento directo no custo biológico da aquisição do plasmídeo de resistência, pelo menos em estirpes com três ou menos PAIs. A participação num estudo internacional com estirpes de E. coli isoladas na Nigéria permitiu comparar as características destes isolados com os isolados portugueses. Apesar de se terem observado diferenças regionais, o clone ST131, plasmídeo IncF e o gene blaCTX-M-15 foram comuns nestes dois paises, suportando o facto que este clone, e os respectivos determinantes de resistência, se encontrarem disseminados mundialmente. O mesmo clone ST131, contendo os determinantes de resistência blaCTX-M-15, blaTEM-type, qnrS e aac(6’)-lb-cr; plasmídeos IncF e IncP, e os factores de virulência PAI IV536, PAI ICFT073, PAI IICFT073, iutA, sfa/foc e papAH foi detectado no efluente de uma Estação de Tratamento de Águas Residuais (ETAR) hospitalar, demonstrandose que as ETARs podem estar a contribuir para a disseminação de bactérias resistentes e virulentas para os ecossistemas naturais, constituindo assim, um risco para a saúde pública e ambiental. A relação entre resistência e virulência foi também estudada para estirpes de K. pneumoniae e K. oxytoca. Em K. pneumoniae, a PAI IV536 foi estatisticamente associada com a resistência à gentamicina e ao sulfametoxazole-trimetoprim (SXT). Neste estudo, a PAI IICFT073 foi descrita pela primeira vez em K. oxytoca, encontrando-se estatisticamente associada com a resistência à cefalotina, cefotaxima, ceftazidima, ciprofloxacina e gentamicina. Contrariamente ao observado em E. coli, não foi detectada uma relação inversa entre virulência e resistência. De facto, em K. pneumoniae, detectaram-se maiores prevalências de factores de virulência em isolados resistentes à ciprofloxacina e à gentamicina, e em menor escala à cefotaxima, e ao SXT. Além disso, também foi observado em K. oxytoca uma maior prevalência de genes de virulência em isolados resistentes ao SXT. Finalmente, foram estudados isolados de um surto de K. pneumoniae multiresistente numa unidade de transplantes renais. Investigaram-se os factores de virulência, determinantes de resistência e a relação clonal. Foram detectadas duas linhagens genéticas principais, o que permitiu excluir a hipótese da ocorrência de um surto provocado por apenas um clone interno. Neste estudo, as ilhas PAI III536 e PAI IICFT073 foram detectadas, pela primeira vez, em K. pneumoniae. Assim, os resultados apresentados nesta tese indicaram que, apesar de se ter verificado uma relação inversa entre virulência e resistência em E. coli, o mesmo não se verificou na generalidade dos isolados do género Klebsiella. Apesar da relação inversa verificada em E. coli, o clone ST131, detectado neste estudo entre isolados portugueses e nigerianos, é um exemplo de como, nesta espécie, podem co-existir traços de virulência e resistência. A relação entre resistência e virulência parece assim ser influênciada pelo género e espécie, factor de virulência em causa e fenótipo e genótipo de resistência.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na área de especialização em Microbiologia e Parasitologia, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/27036
Rights: openAccess
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