Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/26720
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dc.contributor.advisorCosta, José Nascimento-
dc.contributor.advisorRibeiro, Ana Bela Cruz-
dc.contributor.authorCortesão, Emília Nobre Barata Roxo-
dc.date.accessioned2014-08-31T21:23:09Z-
dc.date.available2014-08-31T21:23:09Z-
dc.date.issued2015-04-23-
dc.date.submitted2014-08-31-
dc.identifier.citationCORTESÃO, Emília Nobre Barata Roxo - Caracterização clínica e molecular da síndrome mielodisplásica : implicações no prognóstico e terapêutica. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/26720-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10316/26720-
dc.descriptionTese de doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Medicina, na especialidade de Medicina Interna, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra-
dc.description.abstractA Síndrome Mielodisplásica (SMD) é um grupo heterogéneo de doenças hematológicas caracterizado por citopenia(s) periférica(s) com medula hipercelular, hematopoiese ineficaz devido a aumento da apoptose e proliferação anormal de blastos. Esta patologia está associada a elevado risco de progressão para leucemia aguda com sobrevivência global baixa e resistência às terapêuticas convencionais. A etiologia e patogénese da SMD permanecem pouco esclarecidas. Para além da falência medular e das citopenias periféricas, comuns nas diversas formas de Síndrome Mielodisplásica, a proliferação clonal de progenitores hematopoiéticos associada a mutações genéticas e/ou epigenéticas hereditárias ou adquiridas pode também estar presente. Apesar de múltiplas tentativas para explicar os mecanismos moleculares desta entidade, pouco se sabe sobre a patogénese do passo promotor ou do estádio inicial. As alterações epigenéticas têm sido reconhecidas na última década como factores importantes no desenvolvimento do fenótipo maligno. Os padrões aberrantes de metilação são um mecanismo comum nas neoplasias humanas, especialmente do sistema hematopoiético. Podem estar envolvidos vários genes, dentro dos quais o p15, um gene frequentemente inactivado na SMD por metilação aberrante das ilhas 5’CpG. A inactivação deste gene tem vindo a ser associada ao risco de evolução da doença para leucemia mieloblástica aguda, conferindo mau prognóstico. Outros genes, como o p16, p53, DPAK, MGMT e receptores do TRAIL, têm sido menos estudados em séries de doentes com Síndrome Mielodisplásica. Os polimorfismos funcionais em genes chave, nomeadamente, da enzima metilenotetrahidrofolatoreductase (MTHFR), também podem influenciar a metilação do ADN. São conhecidos dois polimorfismos no gene da MTHFR, C677T e A1298C. Até à data, a Leucemia Mieloblástica Aguda (LMA) e a Síndrome Mielodisplásica constituem desafios terapêuticos porque o único tratamento curativo é o transplante de células pluripotenciais hematopoiéticas. No entanto, a maioria destes doentes apresenta uma média de idades superior a 70 anos, estando mais susceptível aos efeitos colaterais da quimioterapia. Estas dificuldades podem ser ultrapassadas por terapêuticas dirigidas a alvos moleculares que passam pela modulação dos mecanismos epigenéticos envolvidos na patogénese destas neoplasias. Os objectivos deste trabalho foram avaliar as alterações moleculares envolvidas na Síndrome Mielodisplásica, nomeadamente a relevância clinica da célula estaminal leucémica, das alterações epigenéticas e da apopotose na patogénese dos vários subtipos da Organização Mundial de Saúde (OMS), na evolução para Leucemia Aguda, sobrevivência e grupos de risco prognóstico. Além disso, pretendeu-se analisar o potencial terapêutico de fármacos dirigidos a alvos moleculares, como um inibidor da farnesiltransferase (α-HFPA), um inibidor do proteasoma (MG262), um inibidor tirosina cinase (Imatinib) e moduladores epigenéticos (Tricostatina A e Decitabina), identificando a associação com menor dose e maior eficácia terapêutica. Para o efeito estudámos o perfil de metilação de genes reguladores do ciclo celular, p15, p16 e p53, genes moduladores da apoptose, DAPK e receptores do TRAIL, e genes envolvidos na reparação do ADN, como o MGMT, em células da medula óssea de 102 doentes com SMD de novo, utilizando a Polymerase Chain Reaction (PCR) específica de metilação (MS-PCR). Os polimorfismos da MTHFR (C677T e A1298C) foram analisados por PCR Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). A identificação e caracterização da célula estaminal hematopoiética (HSC) e estaminal leucémica (LSC) foi efectuada por citometria de fluxo recorrendo às marcações CD34/CD117/CD123/IL-6/TNF-α. A avaliação das proteínas reguladoras da apoptose (via membranar e mitocondial), em particular as proteínas da família BCL-2, BCL-2 e BAX, o TRAIL e seus receptores, o FAS-L, a IAP survivina, a caspase 3, o citocromo C e a p53, foi também realizada por citometria de fluxo utilizando anticorpos monoclonais marcados com sondas fluorescentes. O potencial terapêutico de fármacos em monoterapia e em associação foi avaliado em uma linha celular de SMD/LMA em cultura, as células F-36P, através de ensaios de proliferação celular recorrendo ao teste de azul de tripano. O tipo de morte celular foi analisado por citometria de fluxo, através da dupla marcação com anexina V e iodeto de propídeo, e por microscopia óptica, após coloração das células com May-Grümwald-Giemsa. Os doentes têm idade mediana de 74 anos (22-89), com uma razão Masculino/Feminino de 0,8. Os subtipos de SMD segundo a Organização Mundial de Saúde são: Citopenia Refractária com displasia multilinha (CRDM) (n=52), Citopenia Refractária com displasia unilinha (CRDU) (n=12), Anemia Refractária com Excesso de Blastos (AREB)-1 (n=8), AREB-2 (n=8), Anemia Refractária com sideroblastos em anel (n=6), Síndrome 5q- (n=4) e Leucemia Mielomonocítica Crónica (LMMC) (n=12) com o seguinte International Prognostic Scoring System (IPSS): baixo (n=37), intermédio-1 (n=39), intermédio-2 (n=10) e alto (n=1). Onze dos 102 doentes evoluíram para LMA. Evidencia-se um predomínio de subtipos menos agressivos, o que se reflecte em índices de prognóstico de risco baixo e intermédio. A análise de parâmetros bioquímicos permitiu identificar a eritropoietina como factor de mau prognóstico, quando elevada, estando associada aos doentes que evoluíram para LMA e a taxas de sobrevivência inferiores. Além disso, os níveis de plaquetas (média mais baixa), a maior percentagem de blastos (média mais elevada) e de células estaminais mielóides com expressão de IL-6 (CD34+/CD117+/IL-6+) e os índices de prognóstico (riscos intermédio e alto) são entre todos os parâmetros avaliados os que podem influenciar a evolução para LMA (p<0,05). Destas variáveis estudadas, somente a LDH e a eritropoietina relevaram impacto na sobrevivência, quando os seus níveis séricos estão elevados. Neste sentido, elaborámos uma proposta de um novo índice de progressão, que denominámos Índice de Progressão para Leucemia Aguda (IPLA). Este índice é caracterizado por uma pontuação que corresponde à soma dos parâmetros: hematológicos e bioquímicos, célula estaminal, metilação e apoptose, quando alterados. Com este tipo de análise verificámos que os doentes com os subtipos da OMS que apresentavam as pontuações mais elevadas foram os que evoluíram para LMA. Desta forma, este novo índice de prognóstico, poderá constituir uma nova “ferramenta” para avaliar o risco de progressão para LMA. A análise da célula estaminal hematopoiética permitiu a identificação de dois grupos de células, um com características fenotípicas “normais”, as HSC, e outro com características neoplásicas, as LSC, as quais expressam diferencialmente IL-6 e TNF-α. No entanto, os resultados são mais evidentes nos doentes do subtipo AREB-2 (a IL-6 predomina na HSC e o TNF-α na LSC). Estes resultados sugerem a relevância destes dois marcadores na distinção destes dois grupos de células estaminais. O estudo da apoptose mostrou um aumento tendencial de moléculas pró-apoptóticas nos subtipos sem excesso de blastos, embora apenas a caspase 3 tenha significado estatístico. Estes resultados corroboram o envolvimento da apoptose na SMD, em particular em doentes de baixo risco, podendo a caspase 3 vir a constituir um novo marcador de diagnóstico e prognóstico em doentes com SMD. Os resultados do perfil de metilação mostram que mais de 50% dos doentes apresentam dois ou mais genes metilados e que, somente 14,7% da população estudada não apresenta metilação de nenhum gene. Como a metilação é um evento mais frequente nos subtipos iniciais da SMD, nesta população, sugere a interferência da metilação numa fase inicial da doença. Os genes mais frequentemente encontrados metilados são os genes p15 e DAPK, em 56% e 54% dos doentes, respectivamente. O genótipo AC do polimorfismo A1298C da MTHFR mostrou associação com a SMD, mas sem relação estatística com os doseamentos séricos do folato e da vitamina B12 ou com o status de metilação dos genes estudados. Os estudos efectuados na linha celular de SMD permitiram a obtenção de dados experimentais relativamente ao potencial terapêutico de novos fármacos em SMD, nomeadamente das associações do α-HFPA com MG262 e/ou Imatinib e da TSA A com a DEC, mostrando que estas combinações induzem diminuição da proliferação das células F-36P de modo dependente da concentração, do tempo de exposição, do modo e esquema de administração dos fármacos, induzindo morte celular preferencialmente por apoptose. Em conclusão, este estudo sugere um papel da metilação na SMD, sobretudo nos grupos de baixo risco, o que poderá alterar a actual abordagem terapêutica. Revelou ainda uma associação entre o genótipo AC do polimorfismo A1298C da MTHFR com a SMD. Permitiu ainda identificar factores de mau prognóstico, como a eritropoietina e a LDH, e um novo índice de risco de progressão para LMA. Além disso, os novos fármacos testados na linha celular poderão constituir uma nova abordagem terapêutica na SMD, em monoterapia ou em esquemas terapêuticos combinados, o que permitirá a diminuição da toxicidade secundária, melhorando a qualidade de vida e a sobrevivência destes doentes.por
dc.description.abstractMyelodysplastic syndromes (MDS) are a heterogeneous group of hematologic disorders characterized by peripheral blood cytopenias with a hypercellular marrow, ineffective hematopoiesis due to increased apoptosis, and an abnormal proliferation of blast cells. These disorders associate with an increased risk of progression to secondary acute leukemia, with a markedly decreased overall survival and resistance to conventional antileukemic drugs. The etiopathogenesis of MDS remains unclear. In addition to the features of bone marrow failure and peripheral cytopenias that are common in MDS, a clonal proliferation of hematopoietic progenitor cells is characteristic of the disorder, resulting from genetic mutations and/or hereditary or acquired epigenetic changes. Despite ongoing attempts at clarifying the molecular mechanisms of this pathologic entity, data about the pathogenesis of the promoting step and of the initial stages of the disease remain scarce. Over the last decade, epigenetic changes have emerged as an important factor in the development of the malignant phenotype. Aberrant patterns of methylation are a common pathogenic mechanism in human neoplastic disorders, especially within the hematopoietic system. Several genes can be involved, including p15, a gene that is frequently inactivated in MDS through the aberrant methylation of 5’CpG islands. The inactivation of this gene associates with an increased risk of progression to acute myeloid leukemia (AML), and with a worse prognosis. Other genes, including p16, p53, DPAK, MGMT and TRAIL receptors, have been less extensively studied in vivo. Functional polymorphisms in key genes, such as the enzyme methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR), can affect DNA methylation. Two such polymorphisms have been described in the MTHFR gene: C677T and A1298C. AML and MDS are still major therapeutic challenges, with the only curative treatment being the transplantation of hematopoietic pluripotent cells. However, affected patients have an average age over 70 years old, which renders them more susceptible to the adverse effects of chemotherapy. These limitations can be overcome by therapies directed at molecular targets, including those responsible for the modulation of the epigenetic mechanisms involved in the pathogenesis of these neoplasms. This study aims to evaluate the molecular changes involved in MDS, especially the clinical relevance of the leukemic stem cell phenotype, of epigenetic changes, and of apoptosis, in the pathogenesis of the different World Health Organization (WHO) MDS subtypes, in the evolution to acute leukemia, and in survival rates and prognostic risk groups. Additionally, the therapeutic potential of drugs directed at specific molecular targets - such as a farnesyltransferase inhibitor (α-HFPA), a proteasome inhibitor (MG262), a tyrosine kinase inhibitor (imatinib) and two epigenetic modulators (trichostatin A and decitabine) – was studied, and the association using the lowest dose with the highest efficacy was identified. The methylation profile of the cell cycle regulator genes p15, p16 and p53, the apoptosis modulator genes DAPK and TRAIL receptors, and the DNA repair gene MGMT, was characterized in bone marrow cells from 102 patients with de novo MDS, through methylation-specific polymerase chain reaction (MS-PCR). The C677T and A1298C polymorphisms of the MTHFR gene were identified through PCR restriction fragment length polymorphism (RFLP). The identification and characterisation of the hematopoietic stem cell (HSC) and the leukemic stem cell (LSC) was achieved through the flow cytometric assessment of CD34, CD117, CD123, IL-6 and TNF-α. The expression of apoptosis regulator proteins from the mitochondrial pathway and the cell membrane pathway, such as the BCL-2 family proteins BCL-2 and BAX, TRAIL and its receptors, FAS-ligand, IAP survivin, caspase 3, citochrome C and p53 was also analysed through flow cytometry. The therapeutic potential of the cited drugs, both in monotherapy and in association, was determined in an MDS/AML cell line (F-36P), through cell proliferation assays and the trypan blue exclusion assay. The type of cell death was determined through flow cytometry, using annexin V and propidium iodide, and through optical microscopy, using the May-Grümwald-Giemsa stain. Patients had a median age of 74 years old (range: 22-89), with a male:female ratio of 0.8. Patients were diagnosed according to WHO criteria as refractory cytopenia with multilineage dysplasia (RCMD) (n=52), refractory cytopenia with unilineage dysplasia (RCUD) (n=12), refractory anemia with excess blasts (RAEB)-1 (n=8), RAEB-2 (n=8), refractory anemia with ring sideroblasts (RARS) (n=6), 5q- syndrome (n=4) and chronic myelomonocytic leukemia (CMML) (n=12), and were classified according to the International Prognostic Scoring System (IPSS) as low risk (n=37), intermidate-1 (n=39), intermediate-2 (n=10) and high risk (n=1). Eleven of the 102 patients progressed to AML. The higher rate of less aggressive WHO subtypes translated into a higher prevalence of low and intermediate risk prognostic groups. The analysis of biochemical parameters identified increased erythropoietin as a negative prognostic factor, associating with decreased overall survival and higher rates of progression to AML. Increased lactate dehydrogenase (LDH) levels were the only other biochemical predictor of decreased overall survival. On the other hand, decreased absolute platelet counts, increased percentage of blasts, increased percentage of IL-6-expressing (CD34+/CD117+/IL-6+) myeloid stem cells, and high IPSS risk groups were also predictors of the evolution to AML. As a result of our findings, we developed a proposal for a new prognostic index, the Acute Leukemia Progression Index (ALPI), calculated through the sum of altered hematologic, biochemical, stem cell, methylation and apoptosis parameters. We observed that patients with the highest scores were the most likely to progress to AML, suggesting that this new prognostic index could be a useful tool to evaluate the risk of progression to over leukemia. Our analyses of the hematopoietic stem cell identified two groups of cells, one with a canonical phenotype (HSC) and the other with neoplastic characteristics (LSC), which a different expression of IL-6 and TNF-α. Although our results suggest that these two markers are useful for the distinction of the two groups of stem cells, those differences were more marked in RAEB-2, with IL-6 prevailing in HSC, and TNF-α in LSC. Apoptosis studies showed a trend towards an increase in pro-apoptotic molecules in the WHO subtypes without excess blasts, although only caspase 3 had statistical significance, corroborating the previously described role of caspase 3 in MDS, especially in low-risk patients, and suggesting that it might be a new diagnostic and prognostic marker. Methylation profiles revealed that over half of patients had two or more methylated genes, while only 14.7% had none. Considering that, in our sample, aberrant methylation is more frequent in early-stage disease, this suggests that methylation is involved primarily in the initial stages of MDS. The genes that were most frequently methylated were p15 and DAPK, in 56% and 54% of patients, respectively. The AC genotype of the A1298C MTHFR polymorphism associated with MDS, but had no association with serum folate or vitamin B12 levels, or with the methylation status of the studied genes. Cell proliferation assays contributed new data on the therapeutic potential of novel drugs in MDS, especially of the associations of α-HFPA with MG262 and/or imatinib, and of trichostatin A and decitabine, which were shown to decrease the proliferation of F-36P cells and induce cell death mostly through apoptosis, in a concentration-dependent mode influenced by the duration of exposure, and the protocol of administration. In conclusion, this study suggests methylation plays a role in MDS, especially in low-risk groups, which could in the future affect the rationale behind current therapeutic approaches. In addition, it showed an association between the AC genotype of the MTHFR A1298C polymorphism and MDS. It also identified negative prognostic markers, such as increased erythropoietin and LDH levels, and proposed a new prognostic index for the progression to AML. The drugs tested in vitro could be a new therapeutic approach in MDS, in monotherapy or in combination, reducing the adverse effects of treatment, while improving the quality of life and overall survival of patients.por
dc.language.isoporpor
dc.rightsopenAccess-
dc.subjectHematologiapor
dc.subjectSíndrome mielodisplásica-
dc.subjectMyelodysplastic syndrome-
dc.titleCaracterização Clínica e Molecular da Síndrome Mielodisplásica - Implicações no Prognóstico e Terapêuticapor
dc.typedoctoralThesispor
dc.identifier.tid101303971-
item.fulltextCom Texto completo-
item.grantfulltextopen-
item.languageiso639-1pt-
crisitem.advisor.deptFaculty of Medicine-
crisitem.advisor.deptFaculty of Medicine-
crisitem.advisor.parentdeptUniversity of Coimbra-
crisitem.advisor.parentdeptUniversity of Coimbra-
crisitem.advisor.researchunitCNC - Center for Neuroscience and Cell Biology-
crisitem.advisor.orcid0000-0002-4142-4841-
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