O impacto da idade na resposta contráctil do íleo isolado de rato à metformina: comparação com um modelo animal de Diabetes Mellitus Tipo 2

Abstract

A Diabetes Mellitus Tipo 2 (DMT2) é uma patologia grave que afeta um elevado número de indivíduos da população mundial, estimando-se que seja responsável por 4.6 milhões de mortes por ano, sendo a idade um dos principais fatores de risco. No seu tratamento são usados fármacos antidiabéticos orais, sendo a metformina o fármaco de primeira linha em indivíduos diabéticos obesos, mas igualmente eficaz em indivíduos diabéticos não-obesos pela melhoria da resistência à insulina e do perfil lipídico. A diarreia é um dos efeitos gastrointestinais adversos associados ao tratamento com metformina (diarreia não diabética), mas sabe-se que esta também está associada per si à patologia (diarreia diabética). Pensa-se que tal facto está relacionado com o envelhecimento dos indivíduos e não apenas com a patologia em si. Desta forma, foi objetivo deste trabalho estudar qual o papel do envelhecimento na contração intestinal induzida pela metformina em ratos Wistar controlo e em ratos Goto-Kakizaki (GK), um modelo animal de DMT2 não-obeso, em duas idades diferentes, 3 meses e 1 ano de idade. Segmentos de íleo de rato foram isolados e preparados para a realização de estudos funcionais de contração isométrica. Foram executadas duas curvas concentração-resposta (CR) (não cumulativas) de metformina (1-36 μM) e de 5-HT (0,1- 60 μM), na presença ou na ausência de reserpina (100 μM), um inibidor do transportador vesicular de monoaminas, e de ritanserina (1 μM), um antagonista não-seletivo dos recetores 5-HT2. Em todas as experiências foram utilizados segmentos controlo, aos quais se adicionou apenas os solventes apropriados para cada fármaco. Segmentos de íleo foram ainda utilizados em cortes histológicos e técnicas de imunohistoquímica, nas quais se utilizou o anticorpo contra a proteína S100β, um marcador de inflamação intestinal enteroglial. Foram ainda quantificados os níveis de TNF- no íleo de rato através da técnica de ELISA. Tanto a metformina como a 5-HT, testadas em concentrações terapêuticas, induziram contrações dependentes da concentração no íleo de ratos Wistar controlos (metformina: Emáx 7,490,66 mN, n=27; pEC50 5,500,31, n=17; 5-HT: Emáx 6,731,25 mN, n=19; pEC50 5,880,18, n=16) e GK diabéticos (metformina: Emáx 12,281,67 mN, n=15; pEC50 5,000,12, n=12; 5-HT: Emáx 11,112,43 mN, n=8; pEC50 6,170,20, n=7). O facto de na presença da patologia se observar uma maior contractilidade intestinal em resposta à metformina em ratos GK com 1 ano comparativamente com os GK de 3 meses, verificando-se exatamente o oposto nos animais controlo, sugere que a uma diarreia não diabética sucede-se, com a idade, uma diarreia diabética. Mais xiv ainda, na presença da patologia, verificou-se que ocorre um comprometimento do efeito da 5-HT libertada pelas células EC em recetores 5-HT2, responsáveis por mediar a resposta contráctil intestinal induzida pela metformina. Tal foi demonstrado com a não alteração da curva CR à metformina pela ritanserina, facto esse mais uma vez não observado nos animais controlo. Dado que foi igualmente observado o comprometimento da via serotonérgica com a idade, a denominada diarreia diabética, traduzida pelo aumento da contractilidade intestinal à metformina e à 5-HT exógena em ratos GK com 1 ano de idade, terá que ter subjacente outros mecanismos que não os envolvendo recetores 5-HT2, nomeadamente fenómenos inflamatórios associados à idade ou associados à Diabetes. De facto, verificaram-se níveis elevados de TNF-, uma citoquina pró-inflamatória, no íleo dos Wistar controlo envelhecidos. Estes estão em concordância com o estado pró-inflamatório que ocorre durante o processo de envelhecimento. Já a imunomarcação para a proteína S100β no tecido linfoide associado à mucosa (MALT) foi mais acentuada nos animais GK, o que sugere uma diarreia de características inflamatórias em animais diabéticos. Em conclusão, os resultados obtidos permitem inferir que, com o envelhecimento, a diarreia que se possa declarar na sequência da toma de metformina, não se deve a um aumento da contractilidade intestinal induzida pelo fármaco em si, como demonstrado nos animais diabéticos adultos, uma vez que se verifica um comprometimento da via serotonérgica com a idade, mas será mais uma diarreia que terá subjacente um processo inflamatório decorrente da idade ou da patologia em si.

Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) is a major problem affecting a high number of the world’s population. This disease is responsible for at least 4.6 million deaths per year and the age of the individuals is one of the major risk factors associated to it. Metformin, an oral antidiabetic agent recommended as the first-line oral therapy for T2DM, is prescribed to obese patients but has also shown efficacy in non-obese ones, as it improves insulin resistance and lipidic profile. Diarrhoea is one of the adverse gastrointestinal complications associated to metformin independent of the pathological status (non-diabetic diarrhoea) but it is also known as part of the symptomatology of the disease (diabetic diarrhoea). This might be associated with the ageing of the patients and not only with the disease itself. Hence, the main goal of this work was to study the impact of age in the metformin-induced intestinal contraction in Wistar control rats and in Goto-Kakizaki (GK) ones, a non-obese T2DM animal model, at two different ages: 3 months old and 1 year old. Ileum segments were isolated and prepared for functional studies of isometric contraction. Two concentration-response (CR) curves (not cumulative) were performed with metformin (1-36 μM) and 5-HT (0.1-60 μM), in the presence or absence of reserpine (100 μM), a vesicular monoamine transporter inhibitor, and ritanserin (1 μM), a nonselective antagonist of 5-HT2 receptors. In each assay, control segments were used with the appropriate solvent of the drug. Ileum segments were also used for histological section and immunohistochemical techniques using the antibody against S100β protein, an enteroglial intestinal inflammation marker. TNF- levels present in the rats’ ileum were also quantified by ELISA. Both metformin and 5-HT, used in therapeutic concentrations, induced concentration-dependent contractions in Wistar (metformin: Emáx 7,490,66 mN, n=27; pEC50 5,500,31, n=17; 5-HT: Emáx 6,731,25 mN, n=19; pEC50 5,880,18, n=16) and GK (metformin: Emáx 12,281,67 mN, n=15; pEC50 5,000,12, n=12; 5-HT: Emáx 11,112,43 mN, n=8; pEC50 6,170,20, n=7) rats’ ileum. In the presence of the disease, a greater intestinal contractility in response to metformin was observed in 1 year old GK rats, in comparison with 3 month old GK ones. The opposite was verified in the controls’ group. This suggests that, after a non-diabetic diarrhoea, a diabetic one appears. Also, in a diabetic state, 5-HT release by enterochrommaffin cells in 5-HT2 receptors, responsible for mediating the intestinal contraction induced by metformin, is affected. This was demonstrated as ritanserin did not alter the CR curve induced by metformin, which was also not seen in control animals. xvi Since we verified that 5-HT signalling is affected by age, the so-called diabetic diarrhoea, in which there is greater intestinal contractility to metformin and exogenous 5- HT in 1 year old GK rats, this might happen by other mechanisms not involving 5-HT2 receptors, namely inflammatory processes associated to ageing or to Diabetes. We also observed high levels of TNF-, a pro-inflammatory cytokine, in the aged Wistar rats’ ileum. These results are in accordance with the pro-inflammatory state that happens during ageing. Concerning the S100β immunohistochemical expression in the mucosa-associated lymphoid tissue (MALT), it was higher in GK animals, suggesting that in diabetic animals an inflammatory diarrhoea is present. In conclusion, these results show us that with the ageing of the animals, the diarrhoea presented by them is not due to the greater intestinal contractility induced by metformin’s administration, as seen in 1 year old diabetic animals. As 5-HT signalling has been shown to be affected by age, the diarrhoea might be associated to an inflammatory process due to ageing or Diabetes.