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Title: Regulation of ataxin-3 by phosphorylation: Relevance for Machado-Joseph disease
Authors: Matos, Carlos Adriano Albuquerque de 
Orientador: Carvalho, Ana Luísa
Ribeiro, Sandra de Macedo
Keywords: Machado-Joseph disease; Ataxin-3; Polyglutamine diseases; Phosphorylation; Doença de Machado-Joseph (DMJ)
Issue Date: 3-Feb-2015
Citation: MATOS, Carlos Adriano Albuquerque de - Regulation of ataxin-3 by phosphorylation : relevance for Machado-Joseph disease. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/26519
Abstract: A doença de Machado-Joseph (DMJ), também designada por ataxia espinocerebelosa tipo 3, é a forma mais comum de ataxia hereditária dominante no mundo. Apesar de ser uma doença neurodegenerativa rara, apresenta considerável prevalência em Portugal, especialmente em algumas regiões do vale do Tejo e no arquipélago dos Açores. A DMJ manifesta-se clinicamente por uma perda progressiva da capacidade de coordenação de movimentos voluntários e por outros sintomas motores e posturais que se agravam progressivamente; a doença é invariavelmente fatal e nenhum tratamento eficaz foi até hoje desenvolvido. O factor genético responsável pela DMJ é conhecido desde há décadas: uma expansão anormal de uma sequência repetitiva de CAG na região codificante do gene MJD1. O gene codifica a ataxina-3 (atx3), uma enzima com actividade de desubiquitinase (DUB) que contém uma sequência de poliglutaminas (poliQ) resultante dos trinucleótidos de CAG, que quando expandida para lá de um valor crítico torna a atx3 tóxica. Embora os mecanismos que estabelecem a ligação entre esta expansão anormal da atx3 e as características neurodegenerativas da DMJ sejam ainda grandemente desconhecidos, acredita-se que o estabelecimento de interacções aberrantes entre proteínas e a agregação de atx3 serão importantes intervenientes na patogénese da DMJ, levando possivelmente ao compromisso de sistemas celulares importantes. Com efeito, apesar de a atx3 ser ubiquamente expressa em diferentes tecidos e tipos celulares, a toxicidade da atx3 expandida afecta unicamente células neuronais, o que indica que os mecanismos patogénicos ocorrem especificamente em neurónios. Sabe-se que a mutação que causa a DMJ – a expansão de poliQ – é também responsável por outras doenças neurodegenerativas, mas as proteínas nelas envolvidas não partilham qualquer homologia para lá da sequência de poliQ. Tendo em conta que cada uma das nove doenças de poliQ é caracterizada por uma degeneração neuronal selectiva que ocorre segundo um padrão distinto, considera-se que a função biológica de cada uma das proteínas que as causam seja um factor importante na definição das consequências toxicas da expansão. Deste modo, os domínios proteicos para lá da sequência de polyQ deverão ser moduladores importantes na toxidade e poderão estar envolvidos nas vias responsáveis pela selectividade celular. O papel biológico da atx3 continua por apurar, mas as informações disponíveis sugerem que esta proteína participa em mecanismos celulares que utilizam sinais de ubiquitinação, como sejam sistemas de controlo de qualidade, ou na regulação da transcrição genética. As modificações pós-traducionais (MPTs) são mecanismos que regulam diversas funções das proteínas e por este motivo acredita-se que possam influenciar a toxicidade das proteínas com sequências de poliQ, através da modificação de domínios que estejam fora da sequência expandida. Para além disso, uma diferente regulação destas proteínas por MPTs poderá ajudar a explicar a especificidade celular dos padrões de neurodegenração. Uma melhor compreensão da função da atx3 e do modo como a proteína é regulada será, por estes motivos, importante para melhor definir os mecanismos patogénicos da DMJ. A fosforilação é uma forma conhecida de MPT que se sabe modificar diversas proteínas envolvidas em doenças de poliQ e interferir com a sua agregação e toxicidade. Tendo isto em conta, procurámos caracterizar quais são os efeitos da fosforilação da serina 12 da atx3, uma MPT que identificámos recentemente por espectrometria de massa usando atx3 purificada a partir de linhas celulares humanas. Nesse sentido, gerámos um anticorpo fosfo-específico direccionado para a detecção de serina 12 fosforilada e determinámos que é possível identificar espécies fosforiladas derivadas de atx3 em linhas celulares de mamíferos e em neurónios corticais de rato. Uma análise estrutural da atx3 demonstrou que a serina 12 se encontra no domínio catalítico da proteina, próximo do local catalítico, fazendo deste resíduo um provável agente regulador da actividade da atx3. Concordantemente, ensaios in vitro demonstraram que mimetizando a fosforilação da serine 12 através da mutação deste resíduo para aspartato reduz a actividade da atx3 contra substratos modelo de ubiquitina, o que indica que esta MPT poderá ser importante na modulação da função da atx3. Demonstrámos também pela primeira vez que a expressão de atx3 com uma expansão de poliQ em neurónios corticais perturba a morfologia dendrítica e diminui o número de sinapses glutamatérgicas funcionais; este tipo de alterações poderá estar envolvido na DMJ. A mimetização da fosforilação reverteu, em certa medida, aquele fenótipo neuromorfológico, o que sugere que a fosforilação da serina 12 poderá ter um papel protector, eventualmente relacionado com algum tipo de função da atx3 na manutenção da estrutura neuronal que nunca fora descrito. No mesmo modelo celular, a mutação da serina 12 para aspartato ou alanina reduz também a formação de agregados de atx3. Os efeitos que a fosforilação da serina 12 tem na toxicidade induzida pela atxs3 expandida foram ainda investigados num modelo lentiviral de DMJ em rato, no qual se demonstrou que a mutação da serina 12 leva a uma diminuição da formação de agregados e a uma redução da depleção de neurónios. Os resultados deste estudo sugerem que a serina 12 da atx3 define a toxicidade da proteína e que a modificação deste aminoácido por fosforilação interfere com as consequências tóxicas da expansão de poliQ. Este trabalho estabeleceu um modelo de cultura de neurónios com aplicações promissoras para o estudo das modificações neuronais resultantes da expansão da atx3 e representa ainda a primeira vez em que os efeitos da fosforilação da atx3 são estudados in vivo.
Machado-Joseph disease (MJD), otherwise known as spinocerebellar ataxia type 3, is the most common form of dominantly-inherited ataxia in the world. Despite being a rare neurodegenerative disease, it is remarkably prevalent in Portugal, particularly in some regions of the Tagus river valley and in the Azorean archipelago. Clinically, MJD is characterized by a progressive impairment of the coordination of voluntary movements and others motor and postural symptoms that aggravate progressively; the disease is invariably fatal and to this date no effective treatment has been developed. The genetic cause of MJD has been known for two decades: an abnormal expansion of a CAG repeat sequence in the coding region of the MJD1 gene. The gene codifies ataxin-3 (atx3), a deubiquitinating enzyme (DUB) that contains a polyglutamine (polyQ) tract encoded by the CAG trinucleotides which upon expansion beyond a critical threshold renders the protein toxic. Though the precise mechanisms linking the abnormal polyQ expansion to the neurodegenerative features of MJD remain to be elucidated, aberrant protein interactions and aggregation are envisioned as important players in pathogenesis, possibly leading to the compromise of important cellular systems. Importantly, though atx3 displays ubiquitous expression throughout diverse tissues and cell types, polyQ-expanded atx3 toxicity affects only neuronal cells, indicating that disease mechanisms are neuronal-specific. The same type of mutation – polyQ expansion – is known to cause other neurodegenerative diseases, but the causative proteins in each of these cases share no homology outside the polyQ tract. Considering that each of the nine polyQ diseases is characterized by distinct patterns of selective neuronal demise, is it believed that the concrete biologic role of each disease-causing protein plays a role in defining toxicity outcomes. Accordingly, protein domains outside the polyQ tract are admitted to be important modulators of toxicity, participating in the mechanisms responsible for cell selectivity. The precise biologic role of atx3 remains to be elucidated, but available evidence suggest a participation in cellular mechanisms utilizing ubiquitination signals, such as protein quality control systems, or transcription regulation. Post-translational modifications (PTMs) are a group of mechanisms that regulate diverse protein functions and are consequently admitted to influence polyQ toxicity by modifying the domains outside the expanded tract. Furthermore, differential regulation of disease-causing proteins between cells by PTMs may help explain the cell-specificity patterns of polyQ-induced neurodegeneration. A better understanding of atx3 function and of how the protein is regulated is crucial for a better characterization of MJD pathogenesis mechanisms. Phosphorylation is a well characterized PTM that has been shown to modify diverse polyQ disease-causing proteins and to interfere with aggregation and toxicity. We thus set out to characterize the effects of phosphorylation of atx3 at serine 12, a PTM we recently identified by a mass spectrometry analysis of atx3 purified from human cell lines. We generated a phospho-specific antibody directed against that modified residue and observed that atx3-derived species are phosphorylated in both mammalian cells lines and in rat cortical neurons. Structural analysis of atx3 revealed that serine 12 is localized in the catalytic domain of the protein, close to the catalytic site, making it a good candidate for an activity regulator. Accordingly, in vitro assays demonstrated that mimicking phosphorylation by mutating serine 12 to aspartate decreases its activity against ubiquitin model substrates, indicating that this PTM may be important in defining atx3 function. We demonstrated for the first time that expression of expanded atx3 is cortical neurons impairs dendritic morphology and diminishes the number of functional glutamatergic synapses, two neuron-specific alterations that may be involved in MJD. Mimicking atx3 phosphorylation limited this neuromorphologic phenotype, suggesting a protective role of serine 12 phosphorylation possibly linked to a yet undescribed function of atx3 in the maintenance of neuronal structure. In the same cell model, mutating serine 12 to aspartate or alanine also reduced atx3 aggregate formation. The effects of serine 12 phosphorylation on expanded atx3-induced toxicity were further explored in a lentiviral rat model of MJD, where mutation of the residue was shown to decrease both aggregate formation and neuronal depletion. The results of this study suggest that serine 12 of atx3 plays a role in defining atx3 toxicity and that modification of this amino acid residue by phosphorylation interferes with the toxic outcomes of polyQ expansion. The current work established a neuronal culture model with promising applications for the further study of neuron-specific changes deriving from atx3 expansion and represents the first time the outcomes of atx3 phosphorylation are studied in vivo.
Description: Tese de doutoramento em Biologia, na especialidade de Biologia Celular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: https://hdl.handle.net/10316/26519
Rights: openAccess
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