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Title: Development, validation and biological application of a novel hybrid 1H/2H NMR method for the determination of lipid biosynthetic fluxes
Authors: Duarte, João André Gonçalves 
Orientador: Jones, John
Burgess, Shawn
Issue Date: 27-Jan-2015
Citation: DUARTE, João André Gonçalves - Development, validation and biological application of a novel hybrid 1H/2H NMR method for the determination of lipid biosynthetic fluxes. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/26411
Abstract: Alterações do metabolismo dos lípidos é uma das principais características de múltiplas doenças tais como cancro e diabetes, como tal, existe muito interesse em determinar de forma correta, fluxos de síntese de lípidos. Contudo, não existe nenhum “golden standard” para medir estes fluxos. Como tal o primeiro objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma nova técnica analítica híbrida de 1H/2H de ressonância magnética nuclear (RMN) para a determinação simultânea de lipogénese de novo, elongação, desaturação de ácidos gordos, assim como a síntese de glicerol e de colesterol. No primeiro capítulo desta dissertação serão dadas as fórmulas matemáticas necessárias para a determinação destes fluxos. Para ter a certeza absoluta que a informação de fluxos providenciada por este método são, em boa verdade, representativas de potenciais mudanças em atividade metabólica, as fórmulas matemáticas foram validadas usando modelos animais que possuem alterações previamente determinadas nessas mesmas vias metabólicas. O método de RMN foi capaz de medir com precisão as mudanças metabólicas previstas em todos os modelos animais testados. Um dos aspetos chave da patologia dos diabetes é a desregulação do metabolismo dos lípidos como evidenciado pela hipertrigliceridémia que ocorre em pacientes diabéticos. Uma particularidade dos diabetes é o aparente paradoxo de resistência seletiva à insulina, isto é, a atividade da insulina sobre o braço glucoreglatório da sinalização torna-se resistente, mas a regulação do metabolismo dos lípidos mantem-se normal, ou mesmo elevada. Contudo, a maioria dos estudos que analisam a resistência seletiva à insulina não fazem análise aos fluxos metabólicos, recorrendo antes aos níveis de RNAm e às quantidades de proteína de algumas enzimas chave para determinar se os fluxos estão alterados. No capítulo 2 desta tese, o método de RMN descrito no capítulo 1 será aplicado para determinar se o fluxo lipogénico está verdadeiramente alterado no contexto dos diabetes e resistência à insulina. Análise aos fluxos efetuada em ratinhos em que os diabetes foram induzidos via alimentação de uma dieta rica em gordura indicam que a lipogénese está, de facto, diminuída nestes animais, sugerindo a possibilidade que as alterações em RNAm e níveis de proteína observadas em estudos anteriores não se traduzem necessariamente num aumento do fluxo através desta via metabólica. Finalmente, no capítulo 3 desta dissertação, o método de RMN será aplicado para estudar os efeitos da forma citosólica da enzima fosphoenolpiruvato carboxikinase (PEPCK-C) na regulação do metabolismo dos lípidos. PEPCK-C é considerada uma das enzimas chave na regulação da gluconeogénese, mas um estudo recente demonstrou que, de facto, a PEPCK-C tem um impacto notavelmente baixo na regulação da gluconeogénese hepática. Estes dados levantam uma questão: se a PEPCK-C não é importante na regulação da gluconeogénese, qual é o seu papel metabólico? Outros estudos indicam que a PEPCK-C é importante para a correta manutenção da homeostasia dos lípidos, visto que animais deficientes desta enzima a um nível global morrem dois dias depois de nascerem, com marcada hipertrigliceridémia e acumulação de lípidos mo fígado. Demonstramos, usando animais que expressam diferentes níveis de PEPCK-C que esta enzima tem um maior controlo sobre a síntese de ácidos gordos, quer no estado pré- ou pós prandial, do que o controlo que exerce sobre a produção de glucose. Os potenciais mecanismos através dos quais a PEPCK-C regula o metabolismo dos lípidos também foi investigado em animais que produzem diferentes níveis de PEPCK-C, sendo que alterações no transporte de metabolitos entre a mitocôndria e o citosol foram identificados como um potencial mecanismo para as mudanças no metabolismo dos lípidos.
Altered lipid metabolism is a hallmark of multiple diseases such as diabetes and cancer, so there is a vast interest in the accurate determination of lipid synthesis fluxes. However, there is no gold standard for measuring these fluxes. Therefore, the initial goal of this project was to develop and validate a novel, non-invasive methodology that could be used to measure these fluxes. Here we describe a novel, hybrid 1H/2H nuclear magnetic resonance (NMR) analytical technique for the simultaneous determination of de novo lipogenesis, elongation, unsaturation, glycerol and cholesterol synthesis fluxes. The first chapter of this dissertation will provide the mathematical formulas necessary for the determination of these fluxes. In order to confirm that the flux readout obtained from the NMR method is actually representative of real metabolic changes, the mathematical formulas where validated by using animal models with known changes in those metabolic pathways. The NMR method was able to accurately determine the predicted changes in metabolic fluxes in all tested animal models. One of the key aspects of diabetes is the dysregulation of lipid metabolism, as evidenced by the hypertriglyceridemia that occurs in diabetic patients. A feature of diabetes is the apparent paradox of selective insulin resistance, i.e., the glucoregulatory branch of insulin signaling becomes resistant, but the regulation of lipid metabolism remains unchanged or even elevated. However, most studies that analyze selective insulin resistance do not perform flux analysis, relying instead on mRNA or protein levels of key enzymes to determine if fluxes are changed. Chapter 2 of this dissertation will apply the NMR method described in chapter 1 to determine if lipid flux was altered in the context of diabetes and insulin resistance. Flux analysis performed in high-fat diet induced diabetic mice indicates that DNL is actually decreased in these animals, suggesting the possibility that the observed differences in mRNA and protein levels in previous studies do not necessarily translate into increased flux through the pathway. Finally, in chapter 3 of this dissertation the NMR method will be applied to determine the effects of the cytosolic form of Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK-C) in the regulation of lipid metabolism. PEPCK-C is considered one of the key enzymes in the regulation of gluconeogenesis, but a recent study showed that, in fact, PEPCK-C has a remarkably low impact in the regulation of hepatic gluconeogenesis. This data raises the question: if PEPCK-C is not important for gluconeogenesis, what is its metabolic role? Previous reports have shown that PEPCK-C is associated with proper maintenance of lipid homeostasis, as animals that are whole body knockouts for this enzyme die within two days of birth, showing remarkable hypertriglyceridemia and accumulation of hepatic fat. Here it is shown that PEPCK-C has a higher control over the synthesis of fatty acids, both in the fed and fasted state, than it does for the regulation of glucose production. The potential mechanisms through which PEPCK-C regulates lipid metabolism were also investigated in mice that express varying levels of PEPCK-C, with dysregulation of shuttling of metabolites between the mitochondria and the cytosol being identified as a potential mechanism for the changes in lipid metabolism.
Description: Tese de doutoramento em Bioquímica, na especialidade de Bioenergética apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: https://hdl.handle.net/10316/26411
Rights: openAccess
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