Identification of intragenic copy number alterations and fusion genes in paediatric high grade glioma

Abstract

Os tumores cerebrais pediátricos são a segundo tumor maligno mais comum em crianças. Estes tumores são a principal causa de morte por cancro nos grupos dos 0-14 e dos 15-24 anos. Nesta tese, centramos os nossos estudos em tumores pediátricos malignos de origem glial (grau III e IV): astrocitomas, oligodendrogliomas, e glioblastomas (GBM). Apesar dos gliomas pediátricos de alto grau serem histologicamente semelhantes aos gliomas adultos malignos, estes são doenças biologicamente diferentes, possuindo perfis de número de cópias de ADN e alterações genéticas diferentes. As recentes iniciativas de sequenciação de última geração demonstraram a existência de sub-grupos de gliomas de alto grau que são caracterizados por mutações distintas: nas crianças (H3F3A K27M), nos adolescentes e jovens adultos (H3F3A G34R/V) e nos adultos de meia-idade (IDH1/2). As aberrações estruturais dos cromossomas dão origem à formação de genes de fusão que estão normalmente associados com cancro, existindo vários casos descritos em cancros de crianças e adultos. No entanto, nos gliomas pediátricos de alto grau apenas alguns genes de fusão foram descritos. Estes rearranjos estruturais normalmente dão origem a proteínas quiméricas que potencialmente podem ser importantes na resposta tumoral à terapia dirigida, algo extremamente necessário para o tratamento desta doença. O trabalho resumido nesta tese pretende explorar os mecanismos moleculares que estão por detrás dos gliomas pediátricos de alto grau, contribuindo desta forma para a distinção entre os gliomas malignos pediátricos e adultos. O PDGFRA é um receptor de tirosina cinase (RTK) que activa várias respostas celulares, tais como a proliferação, a migração e a sobrevivência das células. Este gene está normalmente amplificado e é sobre-expresso em gliomas malignos pediátricos, desempenhando um papel muito importante nesta doença. De forma a determinar se o PDGFRA é alvo de mutações que não são detectadas através da análise do número de cópias de ADN, decidimos estudar a presença de alterações moleculares do PDGFRA (mutações pontuais e pequenas inserções/deleções), assim como a deleção Δ8,9 no PDGFRA e o gene de fusão KDR:PDGFRA (KP), anteriormente descritos em gliomas malignos em adultos. Os nossos resultados demonstraram a presença de mutações somáticas de ganho de função, incluindo mutações missense e deleções/inserções in-frame que não tinham sido descritas anteriormente na literatura. Estas alterações estão presentes em ambos gliomas pediátricos supratentoriais de alto grau e em gliomas pontinos difusos (DIPG). Os nossos estudos demonstraram que as alterações no PDGFRA são mais comuns em gliomas supratentoriais malignos do que em DIPG, e 8/18 (44%) dos casos possuem simultaneamente amplificação e mutação no PDGFRA. Os rearranjos estruturais normalmente presentes em adultos (KP e PDGFRAΔ8,9) foram apenas encontrados num caso de glioma pediátrico de alto grau. Estes resultados indicam que as alterações presentes no PDGFRA em crianças são diferentes daquelas presentes em adultos. Enquanto que as alterações do número de cópias intragénicas (iCNA) e de genes de fusão funcionalmente importantes começam a ser identificados em gliomas de alto grau em adultos, o mesmo ainda não ocorreu nos gliomas pediátricos. Ao aplicar o algoritmo iCNA a um conjunto de dados de perfis do número de cópias de ADN em casos de gliomas pediátricos malignos, previamente publicado pelo nosso grupo, identificamos novas alterações intragénicas. Neste estudo, identificamos 288 eventos iCNA em gliomas pediátricos de alto grau, sendo que a presença destes breakpoints intragénicos é por si só um factor de prognóstico negativo. Quando comparadas com crianças mais jovens, os adolescentes possuem maior número de iCNA. Os tumores que têm a mutação H3F3A K27M também apresentam maior número de iCNA quando comparados com os tumores que tem a mutação H3F3A G34R/V ou com os casos normais. No nosso estudo também observamos inúmeras disrupções de genes por iCNA devido a deleções e amplificações. Os genes alvo destas disrupções estão associados a gliomas malignos, tais como RB1 e NF1, a supressores tumorais putativos, como por exemplo o FAF1 e o KIDINS220, e também a novos candidatos tumorais, como o PTPRE e KCND2. Identificamos também dois novos genes de fusão, CSGALNACT2:RET e DHX57:TMEM178:MAP4K3. De forma a explorar a ocorrência de alterações cromossómicas estruturais que dão origem a proteínas de fusão oncogénicas, utilizamos a sequenciação de ultima geração do ADN e ARN de linhas celulares de gliomas pediátricos de alto grau – KNS42, SF188 e UW479. O nosso estudo mostrou pela primeira vez que estas linhas celulares são caracterizadas por vários genes de fusão. Descobrimos ainda a presença de três estruturas extra-cromossomais presentes na linha celular SF188. Estas estruturas envolvem os cromossomas 4q12 (SCFD2, FIP1L1), 8q24 (MYC), 11p11, 11q13 (CCND1), 11p14, 11q23 (MLL) e o 12q14 (CDK4). Estas regiões estão amplificadas e estão presentes em três estruturas muito complexas sob a forma de double minutes (DM). Caracterizamos ainda um gene de fusão por cada linha celular: o GORASP2:CDADC1 na KNS42, o NUBPL:AKAP6 na UW479 e o RPTOR:TULP4 na SF188. O gene de fusão RPTOR:TULP4 descrito na SF188 envolve o gene RPTOR, um importante componente da via de sinalização do mTOR, e leva a expressão de uma forma truncada do RPTOR. Esta quimera foi encontrada em 2.2% dos gliomas pediátricos de alto grau . Concluindo, o trabalho resumido nesta tese amplia o nosso conhecimento sobre os eventos genómicos característicos destes tumores, e representa novos e potenciais targets para a terapia dirigida, numa doença que ainda não tem cura.

Paediatric brain tumours are the second most frequent malignancy in children, and the most common cause of cancer-related deaths in both the 0-14-year and the 15-24-year age group. In this thesis we focused our studies in paediatric malignant brain tumours of glial origin (grade III and IV): astrocytomas, oligodendrogliomas and glioblastomas. Although, paediatric high grade glioma (pHGG) is a histologically similar tumour to that arising in adults, these are distinct biological diseases, differing in copy number profiles and driver genetic alterations. Recent sequencing initiatives have conclusively shown the existence of subgroups of HGG marked by distinct driver mutations, which are significantly enriched in young children (H3F3A K27M), teenagers and young adults (H3F3A G34R/V), and middle-aged adults (IDH1/2). Structural rearrangements resulting in novel fusion genes are strongly associated with cancer, and numerous examples exist in both adult and childhood malignancies. Although, only few have been described in pHGG. Structural variants (SV) frequently result in chimeric proteins targetable by novel therapeutic approaches, an outcome desperately needed in pHGG. The work summarized in this thesis aims to explore novel structural rearrangements in childhood malignant gliomas, contributing to uncover the molecular mechanisms underpinning pHGG, to further contribute to distinguish the adult and childhood disease. PDGFRA is a receptor tyrosine kinase (RTK) that triggers essential cellular responses such as proliferation, migration, and survival. This gene is commonly amplified and overexpressed in paediatric malignant gliomas, playing an important role in this disease. To determine whether PDGFRA was also targeted by more subtle mutations missed by copy number analysis, we screened a large series of cases for single base changes and small indels, as well as the PDGFRAΔ8,9 deletion and KDR:PDGFRA (KP) fusion gene, previously reported in adult high grade glioma (aHGG). Somatic-activating mutations were identified in nonbrainstem pHGG and Diffuse Intrinsic Pontine Gliomas (DIPG), including missense mutations and in-frame deletions and insertions not previously described. In our studies PDGFRA alterations were more common in pHGG arising outside the brainstem (14% vs 6%), and 8/18 (44%) cases had concomitant amplification and mutation of PDGFRA. The adult rearrangements (KP and PDGFRAΔ8,9) were only found in adult cases and one case of pHGG. Thus, a distinct spectrum of PDGFRA alterations is present in pHGG. As functionally important intragenic copy number aberrations (iCNA) and fusion genes begin to be identified in aHGG, the same has not yet been done in the childhood setting. We applied an iCNA algorithm to our previously published dataset of DNA copy number profiling

in pHGG with a view to identify novel intragenic breakpoints. We reported a series of 288 iCNA events in pHGG, with the presence of intragenic breakpoints itself a negative prognostic factor. We identified an increased number of iCNA in older children compared to infants, and increased iCNA in H3F3A K27M mutant tumours compared to G34R/V and wild-type. We observed numerous gene disruptions by iCNA due to both deletions and amplifications, targeting known HGG-associated genes such as RB1 and NF1, putative tumour suppressors such as FAF1 and KIDINS220, and novel candidates such as PTPRE and KCND2. We further identified two novel fusion genes in pHGG – CSGALNACT2:RET and the complex fusion DHX57:TMEM178: MAP4K3. To further examine whether SVs that lead to the production of oncogenic fusion proteins were present in pHGG, we used whole genome and transcriptome paired end sequencing to detect novel gene fusions in pHGG model cell lines – KNS42, SF188 and UW479. Our study showed for the first time that glioma cell lines are highly rearranged and that they are characterized by several fusion genes. We discovered three extra-chromosomal structural rearrangement structures in SF188, which involve chromosomes 4q12 (SCFD2, FIP1L1), 8q24 (MYC), 11p11, 11q13 (CCND1), 11p14, 11q23 (MLL) and 12q14 (CDK4). The amplified loci represented three very complex structures, which were present in the form of three double minutes (DM). We characterized a fusion gene in each cell line: GORASP2:CDADC1 in KNS42, NUBPL:AKAP6 in UW479 and RPTOR:TULP4 in SF188. The RPTOR:TULP4 fusion gene described in SF188 involved RPTOR, an important component of mTOR signalling. This fusion leads to the expression of a truncated form of RPTOR in SF188. We discovered that RPTOR was disrupted 2.2% of pHGG cases and that patient samples harboured similar truncations to the SF188 cell line. As the roles of these fusion genes are still unclear, further studies need to be performed in order to better understand their role in pHGG. In summary these data expand upon our understanding of the genomic events driving these tumours and represent novel targets for therapeutic intervention in these poor prognosis cancers of childhood.