Endothelial progenitor cells of diabetic patients with acute coronary syndromes: effects of antidiabetic and lipid lowering drugs

Abstract

As Síndromes Coronárias Agudas (SCA) constituem um importante problema de saúde pública. O coração humano adulto possui uma capacidade regenerativa endógena detectável, mas limitada, que tem despertado grande interesse e conduzido a intensa investigação durante os últimos anos. As células progenitoras endoteliais (EPCs) são células estaminais adultas multipotentes, com origem na medula óssea, que são mobilizadas para a circulação periférica em resposta a vários estímulos. As EPCs desempenham um papel crucial na neovascularização pós-natal, sendo essenciais para a reparação vascular do miocárdio isquémico. Os níveis de EPCs circulantes aumentam significativamente em resposta a um enfarte agudo do miocárdio (EAM), salientando a importância da reparação mediada por EPCs como resposta “de sobrevivência” do organismo à isquemia grave. Adicionalmente, tem sido demonstrado que a mobilização das EPCs também pode ser induzida por intervenção farmacológica. Vários fármacos, incluindo estatinas e vários antidiabéticos mostraram aumentar os níveis de EPCs circulantes e/ou melhorar a sua função. A diabetes mellitus tipo 2 (DM) agrava significativamente o prognóstico após uma SCA. Portanto, a modulação farmacológica da resposta endógena das EPCs de forma a facilitar a vasculogénese nos tecidos isquémicos seria extremamente interessante para esta população crescente. No entanto, a desregulação numérica e funcional das EPCs associada à DM é bem reconhecida e traduz-se numa pobre capacidade regenerativa endógena. Isto leva-nos a questionar se o tratamento farmacológico baseado na estimulação de EPCs endógenas será eficaz mesmo em doentes diabéticos. O objectivo global da presente investigação translacional foi estudar o potencial efeito da estimulação farmacológica das EPCs endógenas em doentes com EAM, focando no impacto das estatinas e da insulinoterapia nos níveis e função das EPCs de doentes diabéticos. Os objectivos específicos foram: em primeiro lugar, estudar quantitativa e funcionalmente a resposta das EPCs de doentes diabéticos a um EAM; em segundo lugar, avaliar o impacto do tratamento crónico prévio com estatinas nos níveis de EPCs circulantes nas fases precoces do EAM e do tratamento com estatina de intensidade elevada na alta hospitalar na evolução das EPCs circulantes após o EAM; em terceiro lugar, avaliar os efeitos das estatinas na função das EPCs; e em quarto lugar, avaliar o impacto do tratamento antidiabético crónico na resposta das EPCs a um EAM, em doentes diabéticos. Este projeto foi dividido em duas fases: 1) uma fase in vivo, para caracterização e quantificação das EPCs circulantes em doentes com EAM e 2) uma fase in vitro para avaliação funcional das EPCs. Na primeira fase desta investigação, foram incluídos prospectivamente 100 doentes com EAM e as suas EPCs circulantes (células CD45dimCD34+KDR+, CD45dimCD133+KDR+ e as suas subpopulações co-expressando o marcador de homing CXCR-4) foram quantificadas por citometria de fluxo (FACS), em dois momentos distintos: nas primeiras 24 horas da admissão e 3 meses após o EAM. Os doentes foram seguidos durante 2 anos. Na segunda fase desta investigação, obtivemos EPCs circulantes de 10 doentes diabéticos e 10 não diabéticos, emparelhados por idade, todos do sexo masculino, com EAM com elevação do segmento ST (EAMCST). Para cada doente, realizamos culturas celulares de “early” e “late” EPCs em quatro condições distintas: 1) concentração de glicose normal (controlo); 2) elevada concentração de glicose; 3) concentração de glicose normal na presença de atorvastatina e 4) concentração de glicose normal na presença de pravastatina. Os testes funcionais realizados foram: unidades formadoras de colónias de EPCs (CFU); análise do ciclo celular; avaliação da viabilidade e expressão dos marcadores de superfície CXCR4, CD133, CD34 e KDR. Na análise de FACS, os doentes diabéticos apresentaram níveis de EPCs CD45dimCD34+KDR+ e CD45dimCD133+KDR+ significativamente menores que os doentes não diabéticos com EAM, com uma redução paralela nas subpopulações CXCR4+ (p<0.001). Adicionalmente, observou-se desregulação da resposta das EPCs ao EAM mesmo nos doentes com pré-diabetes e os números de todas as populações de EPCs apresentaram uma relação inversamente proporcional com a hemoglobina glicosilada (r=-0.432, p<0.001 para as EPCs CD45dimCD34+KDR+). A insulinoterapia crónica prévia aparentou atenuar a desregulação da resposta das EPCs diabéticas a um EAM. Por outro lado, o pré-tratamento crónico com estatinas aumentou significativamente os níveis de EPCs circulantes na fase inicial do EAM, mesmo nos doentes diabéticos. Complementarmente, o tratamento com estatina de intensidade elevada na alta hospitalar, preveniu a redução nos níveis de EPCs circulantes que seria expectável durante o período de seguimento clínico. O estudo in vitro mostrou que apesar do profundo distúrbio funcional das EPCs dos doentes diabéticos com EAM, estas células ainda apresentam capacidade de resposta à estimulação das estatinas. Em conclusão, a DM prejudica drasticamente a resposta endógena das EPCs a um EAM, afectando quer os seus níveis quer a sua função. Este distúrbio das EPCs está presente mesmo nos doentes com pré-diabetes. Finalmente, o grau de controlo glicémico parece ser determinante para os níveis de EPCs circulantes e a estimulação farmacológica das EPCs endógenas parece ser um objectivo realista no tratamento do EAM, mesmo em doentes diabéticos.

Acute coronary syndromes (ACS) represent an important public health problem. The adult human heart possesses a detectable, but limited endogenous regenerative capacity, which has attracted much interest and lead to intensive research during the past years. Endothelial progenitor cells (EPCs) are multipotent adult stem cells, originated from the bone marrow, that are mobilized to the peripheral circulation in response to many stimuli. EPCs play a pivotal role in postnatal neovascularization, being essential for vascular repair of the ischemic myocardium. Levels of circulating EPCs significantly increase in response to an acute myocardial infarction (AMI), highlighting the importance of EPCs-mediated repair as a “survival” response of the organism to severe ischemia. Additionally, it has been demonstrated that EPCs mobilization may also be induced by pharmacological intervention. Several drugs, including statins and many antidiabetic agents have been found to increase circulating EPCs levels and/or improve their function. Type 2 diabetes mellitus (DM) significantly worsens outcome following an ACS. Therefore, the pharmacological modulation of endogenous EPCs response to facilitate vasculogenesis in ischemic tissues is of utmost interest in this growing population. However, it is well recognized that both numbers and function of EPCs are impaired in DM, reflecting a poor endogenous regenerative capacity. This raises the question of whether pharmacological therapies based on the stimulation of endogenous EPCs are still effective in diabetic patients. The overall goal of the present translational research was to study the potential of pharmacological stimulation of endogenous EPCs in patients with AMI, focusing on the impact of statins and insulin therapy on EPCs levels and function in diabetic patients. The specific aims were: first, to quantitatively and functionally study the EPCs response of diabetic patients to an AMI; second, to evaluate the impact of prior chronic statin therapy in circulating EPCs levels in the early phases of an AMI and of high-intensity statin therapy at discharge on the evolution of circulating EPCs following the AMI; third, to evaluate the effects of statins on EPCs function; four, to assess the impact of chronic antidiabetic treatment in EPCs response to an AMI in diabetic patients. This project was divided in two phases: 1) an in vivo phase, to characterize and quantify circulating EPCs in AMI patients and 2) an in vitro phase, to functionally evaluate the EPCs. In the first phase of this research, 100 AMI patients were prospectively included and their circulating EPCs (CD45dimCD34+KDR+, CD45dimCD133+KDR+ cells and their subpopulations co-expressing the hom¬ing marker CXCR-4) were quantified by flow cytometry (FACS), in two different moments: within the first 24 hours of admission and 3 months post-AMI. Patients were followed-up for 2 years. In the second phase of this research, circulating EPCs were obtained from 10 diabetic and 10 age-matched non-diabetic male patients with ST segment elevation AMI (STEMI). For each patient, cultures of early and late EPCs were performed under four different conditions: 1) normal glucose concentration (control); 2) high glucose concentration; 3) normal glucose concentration with atorvastatin supplementation and 4) normal glucose concentration with pravastatin supplementation. The functional assays performed were: EPC colony-forming units (CFU); cell cycle analysis; viability assessment and expression of the surface markers CXCR4, CD133, CD34 and KDR. The FACS analysis showed significant lower levels of circulating CD45dimCD34+KDR+ and CD45dimCD133+KDR+ EPCs in diabetic by comparison with non-diabetic AMI patients, with a parallel decrease in the subpopulations CXCR4+ (p<0.001). Indeed, the impaired response of EPCs to an AMI was present even in pre-diabetes and numbers of all EPCs populations were inversely correlated with glycosylated hemoglobin (r=-0.432, p<0.001 for CD45dimCD34+KDR+ EPCs). Previous chronic insulin therapy seemed to attenuate impairment in diabetic EPCs response to the AMI. On the other hand, chronic statin pre-treatment strongly increased circulating EPCs levels in early AMI phase, even in diabetic patients. Additionally, high-intensity statin therapy at discharge prevented the expected decrease of circulating EPCs levels during follow-up. The in vitro study showed that despite the profound functional impairment of EPCs from diabetic AMI patients, they are still responsive to statin stimulation. In conclusion, DM dramatically impairs the response of endogenous EPCs to an AMI, by affecting their numbers and function. This EPCs impairment is already present in pre-diabetic patients. Finally, the degree of glycemic control seems to be determinant for circulating EPCs levels and pharmacological stimulation of the endogenous EPCs seems to be a realistic goal in the treatment of AMI, even in diabetic patients.