Avaliação da integridade da cromatina em espermatozóides humanos : relevância clínica

Abstract

O estado da cromatina e os danos no ADN de espermatozóides podem ser detectados usando ensaios bem estabelecidos baseados em análises de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, por exemplo. Contudo, estes são morosos, envolvem protocolos elaborados e equipamentos sofisticados. O método de coloração Diff-Quik, já implementado para avaliação da morfologia espermática, demonstrou poder ser utilizado como um indicador do estado da cromatina em espermatozóides humanos de forma fácil, rápida e reprodutível em qualquer laboratório de andrologia. Assim, neste trabalho foi avaliado o estado da cromatina de espermatozóides humanos exclusivamente pelo método do Diff-Quik. A integridade da cromatina foi avaliada antes e depois da realização de uma técnica de migração de espermatozóides (swim-up), e o estado da cromatina desses espermatozóides migrados foi correlacionado com os resultados obtidos em diversos parâmetros clínicos relativos a técnicas de reprodução assistida (TRA). Os efeitos do varicocelo (um síndrome anatómico de varizes escrotais), a tomada de um antioxidante na dieta, e a idade do dador no estado da cromatina de espermatozóides foram também estudados. Os resultados obtidos mostraram o benefício da realização das técnicas de preparação de espermatozóides, onde se enquadra o swim-up, na selecção dos que apresentam uma melhor integridade da cromatina. Além disso, a análise dos resultados obtidos com TRA, também mostrou que a presença de danos na cromatina afecta a qualidade do embrião e a existência de uma gravidez clínica, assim como está associada a uma menor taxa de fertilização. Quando analisadas separadamente a fertilização in vitro (FIV) e a injecção intracitoplasmática de um espermatozóide (ICSI) verificou-se que a presença de danos na cromatina afectava a qualidade embrionária e a existência de uma gravidez clínica no caso das FIV, mas somente a qualidade do embrião nas ICSI. Tendo como base as observações do estado da cromatina dos espermatozóides e considerando os vários parâmetros clínicos estudados, a FIV mostrou possuir algumas vantagens em relação à ICSI, resultando num maior número (percentual) de gravidezes. Relativamente ao estudo do varicocelo, e apesar dos espermatozóides destes indivíduos possuírem mais danos na cromatina que os de indivíduos sem varicocelo, não foi verificado qualquer efeito na integridade da cromatina após a embolização, um VII procedimento utilizado para tratar este síndrome. Da mesma forma, o estudo do tratamento oral com antioxidantes, não resultou em efeitos positivos na integridade da cromatina dos espermatozóides após o tratamento. Tal sugere que a menor integridade da cromatina observada, neste caso, não será devido a stresse oxidativo ou que o número de amostras analisadas terá sido escasso. Foi também verificado que os indivíduos subférteis apresentam um aumento dos danos na cromatina a partir dos 35 anos, aparentando serem mais susceptíveis a alterações no ADN de espermatozóides a partir dessa idade. O método do Diff-Quik fornece assim informações úteis em vários aspectos clínicos, demonstrando ser uma mais valia na monitorização da integridade da cromatina em qualquer clínica de reprodução assistida.

Sperm chromatin status and nuclear DNA damage can be detected using well-established assays. Nevertheless, most techniques are time-consuming and involve elaborate protocols and equipment such as fluorescence microscopes and flow cytometers. The Diff-Quik staining, already implemented to assess sperm morphology worldwide, can also be easily, quickly and routinely used as an indicator of the chromatin status in human sperm. Thus, in this study, we only evaluated the status of the human sperm chromatin by the Diff-Quik method. The integrity of the chromatin was assessed before and after the completion of the sperm migration technique (swim-up), and the chromatin status of the migrated sperm was then correlated with the results obtained with assisted reproduction techniques (ART) parameters and indicators. The effects on sperm chromatin status of varicocele (an anatomic syndrome of scrotal varicose veins) of oral antioxidant therapy and of ageing were also analyzed. The results show the benefit of sperm preparation techniques, and specifically of the swim-up method, in the selection of sperm with higher chromatin integrity. Furthermore, the analysis of the results obtained with ART also showed that higher chromatin damage was associated with lower fertilization rates, embryo quality and clinical pregnancy. When we separately analyzed the outcomes of in vitro fertilization (IVF) we found that increased chromatin damage negatively affected embryo quality and the existence of a clinical pregnancy. However, in the case of intracytoplasmic sperm injection (ICSI), only embryo quality was reduced with high chromatin damage. Based on these observations, IVF showed some advantages compared to ICSI, resulting in a greater number of pregnancies. In the varicocele study we found that men with this pathology have more chromatin damage than healthy individuals. However, we failed to find any difference in the chromatin integrity before and after embolization, a procedure used to treat varicocele. Similarly, the oral antioxidant therapy did not show any effect on the sperm chromatin status after treatment. This suggests that either we used a very limited number of samples or sperm chromatin status was not, in this case, related with oxidative stress. It was also found that subfertile men with more than 35 years old have IX higher percentage of sperm with abnormal chromatin status suggesting that they may be more susceptible to changes in sperm DNA. The Diff-Quik method provides useful information on various clinical aspects and may be extremely useful in monitoring sperm chromatin integrity at any assisted reproduction clinic.