Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/26028
Title: Pyruvate dehydrogenase and mitochondrial function in Huntington’s disease – influence of insulin/IGF and histone deacetylase inhibitors
Authors: Rodrigues, Joana Cristina P. 
Orientador: Rego, Ana Cristina
Duarte, Emília
Keywords: Huntington's disease; Pyruvate dehydrogenase; HDAC inhibitors; Insulin; Rhozero cells
Issue Date: 2012
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A doença de Huntington (HD, do inglês „Huntington’s disease’) é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante, caracterizada por perda selectiva dos neurónios estriatais. É marcada por movimentos corporais involuntários (coreia), discurso “arrastado”, dificuldades em engolir, distúrbios emocionais e demência. A HD é causada por uma mutação (expansão de CAGs) no gene IT15 (ou gene HD), que codifica para a proteína huntingtina (Htt). Nos doentes de HD, a Htt mutante (mHtt) apresenta um elevado número de poliglutaminas no seu terminal amínico. De entre vários mecanismos celulares, a mHtt interfere com o sistema ubiquitina-proteassoma, mecanismos apoptóticos, autofagia, transcrição e homeostase mitocondrial. Recentemente foi demonstrado pelo nosso grupo que a actividade e expressão da enzima piruvato desidrogenase (PDH) estão diminuídas em cíbridos citoplasmáticos de HD, resultando em alterações bioenergéticas nessas células. Actualmente, não existe um tratamento para esta doença devastadora. No entanto, evidências anteriores sugerem que a insulina e o insulin-like growth factor-1 (IGF-1) podem actuar como potenciais agentes protectores na HD. Assim, colocámos a hipótese de que ambos os factores neurotróficos poderiam prevenir ou atenuar as alterações bioenergéticas após expressão da mHtt completa (full-length). Para além disso, os inibidores das desacetilases de histonas (iHDACs) podem também ser usados para reverter a disfunção associada à HD, melhorando o processo transcricional alterado após expressão de mHtt. Assim, neste trabalho utilizámos uma linha de células estriatais derivadas de ratinhos (murganhos) knock-in homozigóticos que expressam mHtt com 111 glutaminas (STHdhQ111/Q111) versus células estriatais obtidas de ratinhos wild-type (que expressam Htt com 7 glutaminas) tratadas com insulina, IGF-1, e os iHDACs tricostatina A (TSA), butirato de sódio (SB) e 4-fenilbutirato (PB). Por fim, de modo a estudar o papel da mitocôndria em células humanas que expressam mHtt produziram-se células rho-zero a partir de linfoblastos humanos.Os nossos resultados mostraram que, em comparação com células wild-type, as células estriatais STHdhQ111/Q111 apresentaram maior produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), maior fosforilação/inactivação da PDH e diminuição da actividade da PDH e dos níveis da sua subunidade E1alpha, o que poderá contribuir para a diminuição da viabilidade celular (por aumento da apoptose e necrose). Para além disso, as células STHdhQ111/Q111 exibiram algumas alterações bioenergéticas, incluindo a diminuição dos rácios ATP/ADP e lactato/piruvato, da actividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) e um aumento dos níveis de fosfocreatina (PCr) e piruvato. Por outro lado, a exposição das células ao dicloroacetato, um activador indirecto da PDH, diminuiu a produção de ROS em células STHdhQ111/Q111. A pré-incubação com insulina e IGF-1 não afectou significativamente as alterações bioenergéticas acima referidas. Contudo, observámos um efeito promissor de IGF-1 (1 nM) no restabelecimento da actividade da LDH, assim como uma ligeira diminuição dos níveis de piruvato. Adicionalmente, mostrámos que os iHDACs podem ter efeitos protectores na HD, diminuindo a morte celular por apoptose nas células STHdhQ111/Q111 e, consequentemente, aumentando o número de células viáveis. Ainda, a exposição a SB (500 μM) diminuiu a fosforilação da PDH e aumentou os níveis da sua subunidade E1alpha nas células STHdhQ111/Q111. Por fim, produzimos células rho-zero após tratamento com baixas concentrações de brometo de etídio, durante 27 dias. Porém, o processo de criação de células rho-zero pareceu ser dependente do tipo de linha celular. Assim, serão necessários estudos futuros de forma a definir um protocolo exacto para a criação de células rho-zero a partir de linhas celulares linfoblastóides. A maior limitação parece ser a rapidez com que se observa a repopulação mitocondrial, o que poderá trazer algumas dificuldades à manutenção do estadio rho-zero. Em conclusão, os dados apresentados neste estudo descrevem alguns défices mitocondriais presentes nas células STHdhQ111/Q111, enfatizando a PDH como um importante alvo terapêutico. Adicionalmente, demonstrámos que, no modelo celular testado, os iHDACs (em particular o SB), podem prevenir estes défices de forma mais eficaz comparativamente aos efeitos mediados pela insulina ou IGF-1. Assim, os iHDAC representam uma estratégia terapêutica promissora na HD.
Huntington‟s disease (HD) is an autosomal dominant neurodegenerative disease, characterized by selective neuronal loss of striatal and cortical neurons. It is marked by involuntary body movements (e.g. chorea), slurred speech, difficulties in swallowing, emotional disturbances and dementia. HD is caused by a mutation (CAG expansion) in the IT15 (or HD) gene, which encodes the protein huntingtin (Htt). In HD patients, mutant Htt (mHtt) presents an increased number of polyglutamines in its N-terminal. Among other pathways, mHtt interferes with the ubiquitin-proteasome system (UPS), apoptotic mechanisms, autophagy, transcription and mitochondrial homeostasis. Recent studies from our group have shown that pyruvate dehydrogenase (PDH) activity and expression were decreased in HD cytoplasmic hybrids (cybrids), resulting in changes in mitochondrial bioenergetics in these cells. Currently, there is no effective treatment for this devastating disease. However, previous evidence suggests that insulin, insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and also histone deacetylase inhibitors (iHDACs) may offer potential therapeutic protection against HD. Thus, the aim of this work was to analyze the levels of several energy metabolic parameters and to evaluate the protective effect of both IGF-1 and insulin in these parameters; and, also, to investigate the influence of iHDACs (trichostatin A (TSA), sodium butyrate (SB) and 4-phenylbutyrate (PB)), on PDH protein expression and regulation. For this purpose, we used striatal STHdhQ111/Q111 cell line derived from HD knock-in mice expressing mHtt with 111 glutamines versus striatal cells from wild-type mice (expressing Htt with 7 glutamines) treated with insulin, IGF-1 and the iHDACs. In addition, in order to study the role of mitochondrial dysfunction in HD, we produced rhozero cells from HD patients‟ and control lymphoblasts. Our results showed that, in comparison with wild type cells, striatal STHdhQ111/Q111 cells produced high levels of reactive oxygen species (ROS), increased PDH phosphorylation/inactivation, and decreased PDH activity and E1alpha protein levels, which could contribute for lower cell viability, as a result of increased apoptosis and necrosis. Also, STHdhQ111/Q111 cells showed a decrease in ATP/ADP ratio and lactate dehydrogenase (LDH) activity and increased phosphocreatine (PCr) levels. Moreover,pyruvate levels were increased in mutant cells whereas lactate levels were unchanged. Insulin (0.1 nM) and IGF-1 (1 nM) treatment significantly decreased PCr levels, whereas IGF-1 (1 nM) also decreased pyruvate levels and LDH activity in mutant cells, when compared to wild-type cells. Also, exposure to dicloroacetate, an indirect activator of PDH, decreased ROS production in STHdhQ111/Q111 cells. Additionally, we showed that iHDACs can have protective effects in HD, by decreasing cell death by apoptosis in STHdhQ111/Q111 cells, thereby increasing the number of viable cells. In the presence of SB (500 μM), PDH E1alpha subunit levels increased and PDH phosphorylation decreased in STHdhQ111/Q111 cells. Also, we were able to produce rho-zero lymphoblast cells using ethidium bromide, for 27 days. Nevertheless, the production of rho-zero cells seemed to be dependent on the cell line. Thus, further studies will be needed in order to define a precise protocol to create a rhozero status from lymphoblastoid cell lines. The main limitation seems to be a rapid mitochondrial repopulation, which presents some concerns to the maintenance of rho-zero lines. Data presented in this study describe some mitochondrial deficits present in HD striatal cells, emphasizing PDH as an interesting therapeutic target. Also, we show that, in this cell model, iHDACs (and particularly SB) more efficiently prevented the observed mitochondrial deficits compared to both insulin or IGF-1. Therefore, iHDACs represent a promising therapeutic strategy in HD.
Huntington‟s disease, pyruvate dehydrogenase, HDAC inhibitors, insulin, rhozero cells.
Description: Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/26028
Rights: openAccess
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