Neuroprotection mediated by P2 receptors of NMDA-dependent toxicity in hippocampal slices

Abstract

Excitotoxicity is thought to be one of the main mechanism behind neuronal death under several pathological conditions, like ischemia, epilepsy, trauma and neurodegenerative diseases. It is characterized by the release of high levels of excitatory amino acids, namely glutamate, in the synapse, causing excessive activation of glutamatergic receptors. Among those, NMDA receptors have a prominent role in mediating excitotoxicity. ATP is an important signaling molecule in the central nervous system, and P2 receptors (ATP receptors) are highly expressed both in neurons and in glia. P2 receptors can be divided into ionotropic P2X receptors and metabotropic P2Y receptors. During pathological events in the brain, ATP reaches high extracellular levels, and this molecule is thought to have an important role in mediating the outcome for neurons during this events. ATP may also modulate the activation of astrocytes and microglia, which may be related to the fate of neurons. The hippocampus is a brain structure, highly sensitive to pathological events, composed of three main glutamatergic regions, Dentate Gyrus, Cornus Ammonis 1 (CA1) and Cornus Ammonis 3 (CA3). The aims of this work was to evaluate the P2 antagonist PPADS (20μM) as a neuroprotector against neurotoxicity, in an ex vivo model of acutely dissociated hippocampal slices (400μm thickness), exposed to high levels of NMDA (100μM). Neuroprotection was assessed by trypan blue technique. NMDA caused a raise in the number of cells stained with trypan blue, both in CA1 and CA3 slices of the hippocampus. However, CA1 region showed higher vulnerability to NMDA. PPADS showed a slightly in decrease in the number of trypan blue stained cells in CA1 region, but not in the CA3 region. In slices treated with NMDA, astrogliosis occurred in the CA1 but not in the CA3 region, which can be related to the higher vulnerability of this area to NMDA. GFAP and CD11b immunoreactivity was tested to assess astrogliosis and microgliosis, respectively. Astrogliosis is characterized by cell proliferation, hypertrophy, and by an augmented immunoreactivity for GFAP. PPADS treated slices had no effect on astrocytes. On the other hand, microglia remained inactive even in the presence of NMDA, as they maintained their elongated and ramified morphology. In conclusion, PPADS may be neuroprotective against excitotoxic stimulus, and this effect is mainly due to direct neuronal modulation, since gliosis is not altered in the presence of PPADS.

A excitotoxicidade é um dos principais mecanismos causadores de morte neuronal, associada a várias patologias cerebrais como isquemia, epilepsia, trauma e doenças neurodegenerativas. É caracterizada pela libertação de níveis elevados de aminoácidos excitatórios na sinapse nomeadamente, glutamato, levando a uma activação excessiva de receptores glutamatérgicos. Entre estes, os receptores de NMDA tem um papel proeminente na condução da excitotoxicidade. O ATP tem um papel importante no sistema nervoso central como molécula sinalizadora, e a expressão dos receptores P2 (receptores de ATP) nos neurónios e na glia é muito elevada. Os receptores P2 podem ser divididos em receptores P2X (ionotrópicos) e P2Y (metabotrópicos). O ATP pode chegar a níveis extracelulares elevados no seguimento de eventos patológicos, e esta molécula poderá ter um papel importante na morte ou sobrevivência das células neuronais perante aqueles eventos. A activação de astrócitos e da microglia pode ser regulada por ATP, podendo isto estar associado ao destino dos neurónios. O hipocampo é uma estrutura cerebral sensível a eventos patológicos, e pode ser dividida em três regiões, o Giro Denteado, Cornus Ammonius 1 (CA1) e Cornus Ammonius 3 (CA3). O objectivo do trabalho foi avaliar o papel neuroprotector do antagonista dos receptores P2, PPADS (20μM), a um evento excitotóxico, num modelo ex vivo de fatias de hipocampo (400μm de espessura) expostas a níveis elevados de NMDA (100μM). A técnica azul de tripan foi adoptada para avaliar a neuroprotecção. NMDA causou o aumento do número de células coradas com azul de tripan em ambas as regiões CA1 e CA3 das fatias de hipocampo. No entanto, a região CA1 demonstrou maior vulnerabilidade ao NMDA. O PPADS causou uma diminuição moderada no número de células coradas com azul de tripan na região CA1, mas não na região CA3. Para testar astrogliose e microgliose, foram usados os anticorpos contra GFAP e CD11b, respectivamente. Na região CA1 das fatias de hipocampo expostas a NMDA, astrogliose pôde ser observada, no entanto tal não se verificou na região CA3. Isto poderá estar relacionado com a maior vulnerabilidade ao NMDA observada na região CA1. A astrogliose foi caracterizada por uma proliferação e hipertrofia celular, e também por um aumento na immunoreactividade para o GFAP. Em fatias tratadas com o PPADS não se observou nenhuma alteração na população astrocitária nas regiões estudadas. A microglia, por sua vez, permaneceu inactiva mesmo na presença de NMDA, verificável pela sua morfologia ramificada e elongada. Em conclusão, o PPADS poderá ser neuroprotector contra o estímulo excitotóxico, e isto deverá ser IV devido a um efeito directo na modulação neuronal, tendo em conta que o PPADS não altera o estado de activação das células gliais.