Title: In vitro ischemia-induced changes in the transcriptome of hippocampal neurons: neuroprotective pathways in brain ischemia
Other Titles: Alterações no transcriptoma de neurónios do hipocampo induzidas por isquémia in vitro : vias de neuroprotecção em isquémia cerebral
Authors: Fernandes, Joana Filipa Coelho 
Orientador: Carvalho, Ana Luísa
Santos, Armanda
Keywords: Neuroscience;Neurociências
Issue Date: 24-Jul-2014
Citation: FERNANDES, Joana Filipa Coelho - In vitro ischemia-induced changes in the transcriptome of hippocampal neurons : neuroprotective pathways in brain ischemia = Alterações no transcriptoma de neurónios do hipocampo induzidas por isquémia in vitro : vias de neuroprotecção em isquémia cerebral. Coimbra : [s.n.], 2014. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/25227
Abstract: A isquémia cerebral global devido à interrupção do fluxo sanguíneo no cérebro leva à privação de oxigénio e glicose nas células, reduzindo a energia disponível para manutenção do funcionamento celular. Os neurónios são especialmente sensíveis a esta falha energética, o que pode levar à activação de vias moleculares de morte celular. A região CA1 do hipocampo é particularmente vulnerável à isquémia global. Contudo, os sinais de morte celular surgem apenas horas ou dias após o insulto, criando uma janela temporal na qual podem ser aplicadas estratégias terapêuticas com vista à diminuição dos danos neurológicos causados pelo insulto. Pensa-se que este intervalo se deve a modificações transcripcionais que podem promover a sobrevivência ou a morte neuronal. No entanto, apesar do trabalho desenvolvido na identificação de genes cuja expressão está alterada após a isquémia global, os mecanismos responsáveis pela vulnerabilidade dos neurónios do hipocampo continuam por esclarecer. Assim, este trabalho teve como objectivo a identificação de mecanismos moleculares diferentemente regulados em culturas primárias de neurónios do hipocampo submetidos a um modelo in vitro para a isquémia global, a privação de oxigénio e glicose (do inglês, oxygen and glucose deprivation – OGD). Começámos por estabelecer o protocolo para análise da expressão genética usando este modelo. Verificámos que o estímulo de OGD induz um aumento na morte celular em função da duração do insulto, e que esta é significativa 24h após o estímulo, mostrando que este modelo induz morte celular retardada. Utilizando antagonistas selectivos para os receptores de glutamato do tipo AMPA e NMDA vimos que o bloqueio destes receptores teve um efeito neuroprotector, confirmando o seu papel na componente excitotóxica da morte por OGD. Vimos ainda a activação de calpaínas, proteases ligadas a vias de morte celular. De seguida investigámos as alterações no transcriptoma dos neurónios do hipocampo submetidos a OGD utilizando microarrays. Para isso, o RNA total das células foi extraído 7h e 24h após o estímulo com o objectivo de identificar genes envolvidos na resposta imediata e mais tardia à isquémia. Vimos que às 7h após OGD há uma maior repressão, enquanto 24h após o insulto há uma maior indução, na expressão de genes. A análise da ontologia genética mostrou que genes relacionados com stress oxidativo, metabolismo, apoptose, sinapse e actividade de canais iónicos apresentam diferentes níveis de expressão após OGD. Tanto quanto sabemos, este é o primeiro estudo a combinar microarrays e OGD como ferramenta para estudar alterações no perfil genético de neurónios do hipocampo a diferentes tempos de recuperação. Os resultados obtidos nos microarrays foram validados através da análise de qPCR para genes selecionados, pertencentes a diferentes grupos ontológicos. Observámos também que vários genes codificantes para proteínas da sinapse apresentaram diminuição na sua expressão em neurónios submetidos a OGD, bem como um aumento dos níveis de REST, um factor de transcrição que reprime a expressão de genes codificantes de proteínas neuronais sinápticas, como alguns dos que apresentam diminuição da expressão após OGD. Vimos ainda que este estímulo provoca a diminuição nos níveis de mRNA e proteína da subunidade GluA1 dos receptores AMPA, bem como das subunidades GluN2A e GluN2B e o aumento dos níveis de mRNA da subunidade GluN3A dos receptores NMDA, o que pode levar à alteração da composição destes receptores em neurónios do hipocampo. Estes resultados sugerem que o estímulo de OGD leva à activação de um programa transcripcional que causa uma repressão da expressão de proteínas sinápticas. Por fim, investigámos os níveis de expressão de genes codificantes para canais iónicos e, nomeadamente, a contribuição do canal de cloreto CLIC1 para a morte induzida por OGD, uma vez que o mRNA do CLIC1 está aumentado em neurónios submetidos a OGD. O papel do CLIC1 em neurónios é desconhecido, embora se pense que a activação deste canal em micróglia leva à morte de neurónios em condições tóxicas. Contudo, os nossos resultados mostram que a sobre-expressão do CLIC1 torna os neurónios menos vulneráveis ao dano induzido por OGD, e resultados preliminares sugerem que a expressão do CLIC1 pode estar aumentada em regiões do hipocampo mais resistentes à isquémia global. Os nossos resultados sugerem que o CLIC1 faz parte de um mecanismo intrínseco de protecção activado em neurónios após o insulto isquémico. Os resultados obtidos caracterizam o perfil global de expressão genética induzido por OGD em neurónios do hipocampo, permitindo o estudo de dois mecanismos distintos que podem contribuir para a sobrevivência neuronal: a diminuição da expressão de componentes sinápticos, nomeadamente dos que estão envolvidos na excitotoxicidade, e o aumento na expressão do CLIC1. Estes mecanismos podem ser explorados no sentido de desenvolver estratégias terapêuticas para o tratamento da isquémia cerebral.
Cerebral global ischemia due to interruption of blood supply to the brain results in oxygen and glucose deprivation of brain cells, reducing the energy available to maintain normal cellular functions. Neurons are especially sensitive to this energetic insufficiency and consequently fail to maintain the ionic gradients necessary for cellular function and homeostasis, which ultimately leads to the activation of several molecular pathways that impair neuronal function or may lead to cell death. The neurons of the CA1 region of the hippocampus are particularly vulnerable to global ischemia. However, signs of cell death arise only hours to days after the insult, providing a temporal window in which therapeutical approaches to prevent the delayed neurological and cognitive deficits triggered by ischemia can be employed. This delay is thought to include transcriptional changes that can either prime cell survival or enhance neuronal death. However, despite the effort to identify genes differently expressed after ischemia, the mechanisms responsible for the selective vulnerability of hippocampal neurons to global ischemia remain elusive. As such, the present work was aimed at investigating which transcription-dependent molecular mechanisms are differently regulated in hippocampal neuronal cultures subjected to oxygen and glucose deprivation (OGD), an in vitro model for cerebral global ischemia. Initially, we established the experimental set-up for the analysis of gene expression in this model. We observed an increase in OGD-induced neuronal death as a function of OGD time length, but neuronal death was only significant 24h after the stimulus, showing that OGD induced delayed neuronal death. Selective antagonists of the AMPA and NMDA glutamate receptors were neuroprotective, confirming the contribution of these receptors to the excitotoxic component of this in vitro ischemic model. OGD also triggered the activation of calpains, proteases known to mediate many deleterious effects in post-ischemic neurons. We then used microarray technology to study changes in the transcriptome of rat hippocampal neurons submitted to OGD. For that purpose, total RNA was extracted 7h and 24h after OGD and used in a whole-genome RNA microarray to identify genes related to an early and a delayed ischemic response. At 7h of recovery there is a general repression of genes, while at 24h there is a general induction of gene expression. Analysis of the gene ontology showed that genes related with a variety of cellular functions, such as the response to oxidative stress, metabolism, apoptosis, synapse and ion channel activity, were differently regulated after OGD. As far as we know, no previous study has used microarray technology and the OGD model as a tool to investigate ischemia-induced changes in the transcriptome of hippocampal neurons at different periods of recovery. The validity of the microarray data was confirmed by qPCR analysis of selected genes from different functional groups. According to the microarray data, several synaptic protein genes were down-regulated after OGD. We also observed that OGD triggers the up-regulation of REST, a transcription factor that represses the expression of genes related with the synaptic function. Additionally, OGD decreased the mRNA and protein levels of the GluA1 AMPAR subunit as well as the GluN2A and GluN2B subunits of NMDARs, but increased the mRNA expression of the NMDAR subunit GluN3A, which might lead to a change in the composition of ionotropic glutamate receptors in hippocampal neurons. These results suggest that OGD activates a transcriptional program leading to a general repression of proteins present in the synapse. Moreover, we analyzed OGD-induced changes in the expression levels of ion channel protein genes. In particular, we pursued the contribution of the chloride channel CLIC1 to the OGD-mediated neuronal response. The role of CLIC1 in neurons is largely unknown but it has been suggested to contribute to neuronal death when activated in microglia under toxic conditions. However, we observed that neurons over-expressing CLIC1 are less vulnerable to OGD-induced cell death, and preliminary results suggest that CLIC1 may be up-regulated in the hippocampal regions that are more resistant to ischemia. Overall, these results suggest that CLIC1 can be part of an intrinsic protective mechanism activated in neurons after an ischemic insult. The results obtained in this work present the global expression profile elicited by in vitro ischemia in hippocampal neurons, and help to investigate two different mechanisms that may contribute to neuronal survival in neurons submitted to OGD: decrease in the expression of synaptic components, namely those involved in excitotoxicity, and up-regulation of the chloride channel CLIC1. The targets that we identified may be explored to develop attractive therapeutic strategies for the treatment of cerebral ischemia.
Description: Tese de doutoramento em Ciências e Tecnologias da Saúde (Pré-Bolonha), especialidade de Biologia Celular e Molecular, apresentadas à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/25227
Rights: embargoedAccess
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