Oxidative stress in Huntington's disease knock-in striatal cells

Abstract

A doença de Huntington (DH) é uma doença neurodegenerativa progressiva caracterizada por distúrbios motores e psíquicos e declínio cognitivo, afectando o estriado. A DH é umadoença de poliglutaminas causada por uma expansão de CAGs no gene HTT, conduzindo à expressão de huntingtina mutante (Httm). A proteína mutante tem sido associada a vários mecanismos patológicos, incluindo a desregulação da transcrição, disfunção mitocondrial e stresse oxidativo, que poderá resultar da desregulação da função mitocondrial e/ou do défice de antioxidantes. Neste contexto, o tratamento com compostos utilizados em ensaios clínicos da DH apresentaram actividade antioxidante. Por outro lado, o factor de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1) protegeu as células DH, enquanto a insulina preveniu o stresse oxidativo neuronal. Contudo, o papel da via IGF-1/Akt na DH permanence controverso. O principal objectivo desta tese foi clarificar os mecanismos de (des)regulação redox após expressão da forma completa da Httm. Pretendemos avaliar as alterações de antioxidantes, nomeadamente o sistema redox da glutationa, assim como a eficácia de compostos usados em clínica (creatina e cistamina) com potencial actividade antioxidante, e o papel da insulina/IGF na regulação do stresse oxidativo na DH. Para tal, utilizámos células do estriado derivadas de murganhos knock-in para a DH, que expressam a Httm com 111 glutaminas (STHdhQ111/Q111; células mutantes) versus células wild-type (STHdhQ7/Q7). Na primeira parte deste trabalho determinámos as alterações do sistema redox da glutationa através da análise da actividade e expressão de proteínas envolvidas na regulação dos níveis de glutationa em células estriatais DH. As células mutantes mostraram um aumento de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e da actividade da caspase-3. Surpreendentemente, as células mutantes exibiram um aumento dos níveis intracelulares de glutationa reduzida e oxidada (GSH, GSSG), e um aumento das actividades de enzimas relacionadas com a glutationa. No entanto, as actividades da glutamato-cisteína ligase (GCL) e da glutationa sintetase e os níveis da subunidade catalítica da GCL diminuíram em células DH, sugerindo uma diminuição da síntese de novo da glutationa. Um aumento dos níveis totais intracelulares de glutationa, apesar da diminuição da síntese, foi explicado pela redução da exportação da glutationa em células mutantes. De facto, observou-se um decréscimo da expressão de mRNA e actividade da proteína-1 associada à resistência a múltiplas drogas (Mrp1). Estes resultados sugeriram que a Httm afecta a exportação da glutationa através do decréscimo da expressão do Mrp1. Por outro lado, o aumento dos mecanismos de defesa antioxidante induzidos pela Httm não foi suficiente para contrabalançar a formação de ROS e as características apoptóticas em células estriatais de DH. Na segunda parte do trabalho analisámos o perfil antioxidante celular após a exposição a péroxido de hidrogénio (H2O2) e estaurosporina (STS), e testámos o efeito protector da cistamina e creatina em células do estriado. As células mutantes mostraram um aumento da produção de ROS mitocondriais e uma diminuição das actividades da NADPH oxidase e da xantina oxidase (XO), reflectindo baixos níveis de anião superóxido citosólico, assim como um aumento da actividade das superóxido dismutases (SODs) e componentes do ciclo redox da glutationa. A exposição ao H2O2 e à STS aumentou os níveis de ROS em células mutantes e aumentou largamente a actividade da XO; a STS aumentou também a geração de ROS mitocondriais e a actividade da caspase-3. Ambos os estímulos aumentaram ligeiramente a actividade da SOD1 (Cu/Zn-SOD), e diminuíram a actividade da GRed, com um aumento consecutivo da GSSG em células mutantes, enquanto que o H2O2 apenas aumentou a actividade da GPx. Estes resultados indicaram que a geração de ROS mitocondriais é acompanhada pelo aumento de actividade do sistema antioxidante em células do estriado mutantes e que a exposição a estímulos nocivos induz um aumento da susceptibilidade ao stresse oxidativo através do aumento da actividade da XO e da diminuição da resposta antioxidante. Adicionalmente, a creatina e a cistamina aumentaram a viabilidade celular e preveniram a formação de ROS em células DH submetidas a H2O2 e STS. Na terceira e última parte deste trabalho analisámos o papel da insulina/IGF-1 em células do estriado DH contra a produção de ROS e os mecanismos antioxidantes e de sinalização intracelular relacionados. A insulina e o IGF-1 diminuiram a formação de ROS derivados da mitocôndria induzidos pela Httm, sem alterarem a actividade da SOD2 ou os níveis de glutationa. A insulina e o IGF-1 promoveram a fosforilação do Akt e da cinase regulada por sinais extracelulares (Erk), respectivamente, e aumentaram os níveis nucleares do factor de transcrição nuclear Nrf2fosforilado, que regula a expressão de genes antioxidantes e de destoxificação celular; contudo, este resultado não foi relacionado com a actividade transcripcional do Nrf2 ou com alterações nos níveis de mRNA de genes alvo do Nrf2. O tratamento com insulina e IGF-1 também melhorou a função mitocondrial de células DH. No caso da insulina, este mecanismo ocorreu de forma dependente da via fosfoinositol 3-cinase (PI-3K)/Akt, em simultâneo com um decréscimo da activação da caspase-3 induzida pela Httm. Assim, a insulina e o IGF-1 melhoraram a função mitocondrial e reduziram a formação de ROS mitocondriais induzidos pela Httm, e estimularam diferencialmente Akt e ErK, num processo independente da actividade transcripcional do Nrf2. O trabalho apresentado nesta tese ajudou a clarificar a desregulação do perfil antioxidante e a sinalização celular que ocorre após a expressão da Httm em células estriatais. Para além disso, demonstrou-se uma maior susceptibilidade destas células ao stresse e à morte celular por apoptose, que poderá ser melhorada após o tratamento com citamina ou creatina, e após estimulação da cascata de cinases pela insulina ou IGF-1. Desta forma, este trabalho contribuiu para definir possíveis alvos de intervenção terapêutica que poderão reduzir a progressão da doença e melhorar os sintomas da DH.

Huntington’s disease (HD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by motor and psychiatric disturbances and cognitive decline, largely affecting the striatum. HD is a polyglutamine expansion disorder caused by a CAG expansion in the HTT gene, leading to the expression of mutant huntingtin (mHtt). Themutant protein has been linked to several pathological mechanisms, including transcriptional deregulation, mitochondrial dysfunction and oxidative stress, which may result from impaired mitochondrial function and/or imbalanced levels of antioxidants. In this respect, several compounds used in HD clinical trials present antioxidant activity, including creatine and cystamine. Also, insulin-like growth factor 1 (IGF-1) was previously shown to protect HD cells, whereas insulin prevented neuronal oxidative stress. However, the role of IGF-1/Akt pathway in HD remains controversial. The main objective of this thesis was to clarify the redox imbalance pathways following expression of full-length mHtt. We aimed to detail the changes in the antioxidant status, namely the glutathione redox system, and the efficacy of compounds with potential antioxidant activity used in clinical trials, as well as the role of insulin/IGF-1 pathway on oxidative stress in HD. Thus, we used striatal cells derived from HD knock-in mice expressing full-length mHtt with 111 glutamines (STHdhQ111/Q111; mutant cells) versus wild-type striatal cells (STHdhQ7/Q7). In the first part of this work we detailed the changes in the glutathione antioxidant system by determining the activity and expression of proteins involved in the regulation of glutathione levels in HD striatal cells. Mutant cells showed increased reactive oxygen species (ROS) and caspase-3 activation. Interestingly, HD cells exhibited an increase in intracellular levels of both reduced and oxidized glutathione (GSH, GSSG), and enhanced activities of glutathione-related enzymes. Nevertheless, glutamate-cysteine ligase (GCL) and glutathione synthetase activities and levels of GCL catalytic subunit were decreased in mutant cells, suggesting decreased de novo synthesis of GSH. Enhanced intracellular total glutathione, despite decreased synthesis, could be explained by decreased glutathione export in mutant cells. Concordantly, we observed decreased mRNA expression levels and activity of the multidrug resistance-associated protein 1 (Mrp1). Data suggested that full-length mHtt affects the export of glutathione by decreasing the expression of Mrp1. Moreover, boosting GSH-related antioxidant defence mechanisms induced by full-length mHtt was apparently insufficient to counterbalance increased ROS formation and emergent apoptotic features in HD striatal cells. In the second part of the work we analysed the cellular antioxidant profile following hydrogen peroxide (H2O2) and staurosporine (STS) exposure, and further tested the protective effect of cystamine and creatine in striatal cells. Mutant cells displayed increased mitochondrial ROS production and decreased NADPH oxidase and xanthine oxidase (XO) activities, reflecting lower cytosolic superoxide anion generation, along with increased superoxide dismutases (SODs) and components of glutathione redox cycle. Exposure to H2O2 and STS enhanced ROS in mutant cells and largely increased XO activity. STS further boosted mitochondrial ROS and caspase-3 activity. Both stimuli slightly increased SOD1 activity, and decreased GRed, with a consequent rise in GSSG in mutant cells, whereas H2O2 only increased GPx activity. These results indicated that elevation of antioxidant levels accompanies mitochondrial-driven ROS generation in mutant striatal cells and that exposure to noxious stimuli induces a higher susceptibility to oxidative stress by increasing XO activity and lowering the antioxidant response. Additionally, creatine and cystamine increased mutant cells viability and prevented ROS formation in HD striatal cells subjected to H2O2 and STS. In the third part of this work we analysed the role of insulin/IGF-1 in HD striatal cells against ROS production and related antioxidant and signaling pathways. Insulin and IGF-1 decreased mitochondrial-driven ROS formation induced by mHtt, without changing SOD2 activity or glutathione levels. Insulin and IGF-1 promoted Akt and extracellular signal-regulated kinase (Erk) phosphorylation, respectively, and increased nuclear levels of phosphorylated nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2), which regulates the expression of detoxifying and antioxidant genes; however, this was not correlated with Nrf2 transcriptional activity or changes in mRNA levels of some Nrf2 target genes. Insulin and IGF-1 treatment also ameliorated mitochondrial function in HD cells. In the case of insulin, this occurred in a phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/Akt-dependent manner, concomitantly with reduced caspase-3 activation evoked by mHtt. Hence, insulin and IGF-1 improved mitochondrial function and reduced mitochondrial-driven ROS induced by mHtt, along with differential stimulation of Akt and Erk, in a process independent of Nrf2 transcriptional activity. The present work defined the changes in antioxidant profile and cellular signaling following expression of full-length mHtt in mice striatal cells, demonstrating a higher susceptibility of these cells to stress and apoptotic cell death, thus revealing possible targets for therapeutic intervention in HD. Importantly, treatment with cystamine and creatine rescued oxidative stress caused by stress stimuli, whereas activation of insulin or IGF-1 receptor-mediated kinase cascades reduced mitochondrial-driven oxidative stress through Nrf2-independent pathway in HD knock-in striatal cells, thus potentially delaying disease progression.