O efeito da anfetamina na contractilidade do íleo de rato : estudos in vitro e in vivo

Abstract

O abuso da anfetamina está associado a graves efeitos neurológicos, psiquiátricos e cardiovasculares. No entanto, os efeitos no altamente inervado tracto gastrointestinal são imprevisíveis. A anfetamina está estrutural e funcionalmente relacionada com as aminas vestigiais para-tiramina. As aminas vestigiais e as anfetaminas têm a habilidade de inibir a libertação extracelular de transmissores e/ou estimular o efluxo de transmissores a partir de reservas intracelulares, incluindo a 5-hidroxitriptamina (5- HT). Foi recentemente descrito que as anfetaminas e as aminas vestigiais são agonistas potentes de um novo receptor acoplado à proteína G, que estimula a produção de AMPc, o trace amine-associated receptor 1 (TAAR1). Foi também sugerido que alguns dos efeitos da anfetamina possam ser mediados, em parte, por esse receptor. De forma a entender o mecanismo envolvido nos efeitos adversos da anfetamina a nível gastrointestinal, o objectivo deste trabalho foi caracterizar farmacologicamente o receptor que medeia a resposta contráctil do íleo isolado de rato à anfetamina. Ratos Wistar machos foram sacrificados e o íleo removido e preparado para contracções isométricas de curvas concentração-resposta (CR) de adições independentes à 5-HT (0,1 μM – 60 μM), à tiramina e à anfetamina (1 μM – 6000 μM). Após a adição de 100 μM de acetilcolina (de forma a comparar os resultados), antagonistas de diferentes receptores foram adicionados ao banho de órgãos 15 minutos antes de cada dose da curva CR. Em todas as experiências foram utilizados segmentos controlo, aos quais se adicionou apenas o solvente apropriado para cada composto. Os segmentos de íleo foram também utilizados para cortes histológicos e técnicas de imunohistoquímica de forma a estuder a imunoreactividade de subtipos de receptores 5-HT. Foram ainda realizados estudos in vivo com o intuito de estudar o comportamento do rato após a administração de anfetamina e a sua neurotoxicidade e as possíveis consequências de tal administração na função intestinal, isto é, na resposta contráctil do íleo isolado de rato. Para tal, foi administrado 15 mg/Kg de solução salina de anfetamina aos animais ensaio e solução salina aos animais controlo. A administração foi via intraperitoneal. O comportamento assim como a temperatura foram registadas. Os animais foram sacrificados 24 horas após a administração e recolheu-se estriado, para quantificação dos níveis de monoaminas, e íleo, para estudos funcionais e imunohistoquímicos. Os estudos funcionais consistiram na realização de curvas CR de adições independentes à anfetamina e à 5-HT na ausência de qualquer antagonista. As diferenças estatísticas foram analisadas pelo teste t de Student e ANOVA seguido do teste de comparações múltiplas de Dunnett ou Tukey. Tanto a anfetamina como a tiramina induziram contracções dependentes da concentração no íleo de rato com idêntica actividade intrínseca e potência (anfetamina: Emáx de 10,51 ± 1,35 mN; pEC50 de 4,64 ± 0,19, n=25; tiramina: Emáx de 11,54 ± 1,65 mN; pEC50 de 4,09 ± 0,32, n=13). As curvas CR à anfetamina não foram significativamente alteradas pela atropina (1 μM) ou mepiramina (1 μM), excluindo o envolvimento de receptores muscarínicos e da histamina H1. No entanto, a cetanserina (1 μM), um antagonista dos receptores 5-HT2A/2C e o RS 127445 (0,05 μM), um antagonista selectivo dos receptores 5-HT2B, alteraram de forma significativa a curva CR à anfetamina. De facto, a ritanserina (1 μM), um antagonista não selectivo dos receptores 5-HT2A/2B/2C, aboliu completamente a contracção intestinal induzida pela anfetamina, apontando para o envolvimento da 5-HT2 no efeito provocado pela anfetamina. Alterações semelhantes e significativas foram, igualmente, observadas nas curvas CR à 5-HT na presença de cetanserina, RS 127445 e ritanserina. Além disso, os estudos imunohistoquímicos revelaram imunoreactividade para os receptores 5-HT2A e 5-HT2B nas células ganglionares do plexo mientérico e submucoso, mas não nas células musculares lisas das camadas longitudinal e circular. Além disso, o recentemente descrito antagonista selectivo do TAAR1, N-(3-etoxi-fenil)-4-pirrolidin-1- il-3-trifluorometil-benzamida (EPPTB), 5 μM, alterou significativamente (com redução do Emáx) as curvas CR à anfetamina e à tiramina, sugerindo igualmente o recrutamento do TAAR1. Uma vez que a reserpina (100 μM) aboliu completamente a contracção intestinal induzida pela anfetamina, e que cerca de 90% da 5-HT é sintetizada, armazenada e libertada essencialmente por células enterocromafins no intestino, propomos que a anfetamina possa desencadear a libertação de monoaminas a partir das células enterocromafins, embora mais estudos serão necessário para provar, definitivamente o envolvimentos do TAAR1 através da sua localização celular. Relativamente aos estudos funcionais realizados com os íleos dos ratos controlo e sujeitos a 15 mg/Kg de anfetamina, não foram observadas alterações estatisticamente significativas nas curvas CR à anfetamina e à 5-HT, demonstrando não haver alterações relevantes na função intestinal. Os ratos que foram administrados com anfetamina ficaram hipertérmicos durante cerca de 90 minutos e mostraram comportamentos estereotipados. Relativamente à quantificação dos níveis de monoaminas, só a dopamina diminui de forma significativa, demonstrando alguma neurotoxicidade nos ratos sujeito ao fármaco após 24 horas. Em conclusão, este estudo demonstra, pela primeira vez, que tanto a 5-HT como os trace amine-associatede receptors contribuem para a resposta contráctil do íleo de rato à anfetamina.

Amphetamine (AMPH) misuse is associated with serious neurologic, psychiatric and cardiovascular adverse effects. However, its effects on the highly innervated gastrointestinal tract are unpredictable. AMPH is structurally and functionally related to the trace amine para-tyramine. Trace amines and amphetamines have the ability to inhibit the clearance of extracellular transmitter and/or stimulate the efflux of transmitter from intracellular stores, including 5-hydroxytryptamine (5-HT). It was recently reported that amphetamines and trace amines are potent agonists of a novel G protein-coupled receptor that stimulates the production of cAMP, the trace-amine-associated receptor 1 (TAAR1). It was also suggested that some effects of amphetamines may be mediated in part by this receptor. In order to further understand the mechanism involved in the gastrointestinal adverse effects of AMPH, the aim of this study was to characterize pharmacologically the receptor mediating the contractile response of the rat isolated ileum to AMPH. Male Wistar rats were sacrificed and the ileum was removed and prepared for isometric contractile concentration-response (CR) curves (not cumulative) for AMPH, tyramine (1 μM – 6000 μM) and 5-HT (0.1 μM – 60 μM). After 100 μM acetylcholine (in order to compare the results), antagonists of different receptors were added to the organ bath 15 min before each dose of the CR curve. In each assay, control segments were used with the appropriate solvent of each drug. Ileum segments were also used for histological section and immunohistochemical techniques to study the immunoreactivities of 5-HT receptors subtypes. Studies have been conducted in vivo in order to study the behavior of rats and AMPH neurotoxicity after administration of AMPH, and also the possible consequences of such administration in the intestinal function (contractile response of rat ileum). A group of rats were injected intraperitoneally with 15 mg/Kg of AMPH and the control group of rats were injected with a saline solution. The behavior and the temperature were recorded. The animals were sacrificed 24 hours after the administration and the striatum was collected to quantify monoamines levels. The ileum was also collected for functional and immunohistochemical studies. The ileum was prepared for isometric contractile CR curves (not cumulative) for AMPH and 5-HT in the absence of antagonists. Statistical differences were evaluated by Student´s t test and ANOVA with Dunnett’s or Tukey's multiple comparison test. Both AMPH and tyramine caused concentration-dependent ileum contractions with similar intrinsic activity and potency (AMPH: Emax of 10.51 ± 1.35 mN; pEC50 of 4.64 ± 0.19, n=25; tyramine: Emax of 11.54 ± 1.65 mN; pEC50 of 4.09 ± 0.32, n=13). AMPH CR curves were not significantly altered by atropine (1 μM), or mepyramine (1 μM) excluding the involvement of muscarinic and H1 histamine receptors on AMPH effect. However, ketanserin (1 μM) a 5-HT2A/2C antagonist and RS 127445 (0.05 μM), a selective 5-HT2B antagonist, changed the AMPH CR curve. In fact, ritanserin (1 μM), a non-selective 5-HT2A/2B/2C antagonist abolished completely the AMPH-induced intestinal contraction which points to the involvement of 5-HT2 on the AMPH effect. Significant and similar changes on the 5-HT CR curve were also observed in the presence of ketanserin, RS 127445 and ritanserin. Furthermore, the immunohistochemical studies revealed immunoreactivity for the 5-HT2A and 5-HT2B receptor on ganglionary cells of the mienteric and submucous plexus but not in the smooth muscle cells of the longitudinal and circular layers. Moreover, the recently described TAAR1 selective antagonist, N-(3-ethoxy-phenyl)-4-pyrrolidin-1-yl-3-trifluoromethyl-benzamide (EPPTB), at 5 μM, significantly changed (with a reduction of the Emax) the CR curves for both tyramine and AMPH, suggesting also the recruitment of TAAR1. Since reserpin (100 μM) abolished completely the AMPH-induced intestinal contraction, and about 90% of serotonin is synthesized, stored and released mainly by enterochromaffin cells in the gut, we propose that AMPH may trigger the release of the monoamine from enterochromaffin cells, though further studies are needed to definitely prove the involvement of the TAAR1 through its cellular location. For the functional studies performed with the ileums from control rats and rats subject to 15 mg/Kg AMPH, there were no statistically significant changes in the AMPH and 5-HT CR curves, showing no relevant changes in intestinal function. The rats which were subjected to AMPH became hyperthermic for about 90 minutes and stereotyped behaviours were shown. Regarding the results of quantification of monoamines levels, only dopamine levels decreased significantly, showing some neurotoxicity in rats subjected to the drug after 24 hours. In conclusion, this study shows for the first time that both 5-HT and trace amineassociated receptors contribute to the contractile response of the rat isolated ileum to AMPH.